下调lmna基因促进斑马鱼胚胎细胞凋亡

李雪华，侯仕芳，周艳华，何志旭，*，舒莉萍，，4*

(贵州医科大学 1.临床医学院 儿科学教研室； 2.组织工程与干细胞实验中心； 3.基础医学院 免疫学教研室；4.动物实验中心，贵州 贵阳 550004)

lmna(lamin A/C)基因是核纤层蛋白合成的关键基因，是细胞核形态及功能的主要决定因素，与基因复制、转录翻译活动密切相关。lmna突变可导致早衰[1-2]，目前尚未发现有效治疗方法。因此，研究LMNA下调时细胞凋亡机制对寻找核纤层蛋白病治疗方法有一定意义。

吗啡代寡核苷酸(morpholine oligonucleotide, MO)通过抑制mRNA的剪切和翻译来抑制基因表达。有研究证实：将lmna-EGFP-pCS2+质粒同特异性吗啉代寡核苷酸共注入斑马鱼单细胞期的胚胎，各时相胚胎中绿色荧光均消失，说明lmna-MO能有效下调lmna基因[3]。

AKT磷酸化是激活AKT通路的重要一步，p-AKT通过抑制凋亡而促进细胞存活[4]。激活的AKT能够使丝氨酸、苏氨酸磷酸化，从而诱导抗凋亡蛋白基因的表达。BCL-2家族可辨识促凋亡成员，避免细胞进入凋亡。细胞的存活受到AKT、BCL-2蛋白的共同调控，且AKT的表达对BCL-2起着重要的调控作用[5-6]。本研究利用吗啉代寡核苷酸技术下调斑马鱼lmna基因，探讨核纤层蛋白异常与细胞凋亡机制之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:野生型Tüebingen斑马鱼系由本课题组自行饲养培育。养殖方法：在带有过滤和消毒的恒温循环水系统中进行养殖，光照时间12 h/d,水温(28±2)℃，喂食草履虫及丰年虫。

1.1.2 试剂:Western blot免染胶试剂盒(Bio-Rad公司)、一抗(S473 p-AKT蛋白、AKT蛋白、BCL-2蛋白)(Gene Tex公司)、Annexin-V PE/7AAD凋亡试剂盒(BD公司)、蛋白酶K(Sigma公司)，PBS溶液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(四季青试剂公司)，二抗、电泳液、转膜液、TBST溶液(碧云天试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 下调斑马鱼lmna基因：采用显微注射技术，将lmna-MO注射入单细胞时期的斑马鱼胚胎中，放入温箱(30±2)℃保存，待胚胎发育至24和72 h进行实验。

1.2.2 流式细胞计量术检测凋亡：每组收集胚胎50枚，用1×PBS清洗3次，冰上研磨，加入500 μL 0.25%的胰蛋白酶，38 ℃水浴30 min，每隔10 min吹吸1次；加入1 mL FBS，将组织液放入BD膜中过滤后移至新离心管中；800 r/min离心5 min，去上清；加入0.9×PBS/FBS 500μL，800 r/min离心5 min，去上清；加入0.9×PBS/FBS 100 μL和1×PBS 300 μL轻混匀；避光加入Annexin-V PE/7AAD凋亡试剂。为保证实验数据的真实性及可靠性，需重复实验3次以上。

1.2.3 Western blot检测凋亡蛋白的表达:每组收集胚胎各50枚，用1×PBS清洗3次，加入蛋白裂解液，冰上研磨，3 537 r/min离心5 min，取上清；加入蛋白缓冲液，沸水中煮5～10 min，直至蛋白质充分变性，-80 ℃保存；配胶过程按试剂盒说明书操作，灌胶后插入梳子， 30 min后取出梳子， 上样， 电泳250 V恒压30 min，PVDF膜甲醛浸泡，300 mA恒流转膜2 h，摇床封闭1 h；剪膜；4 ℃摇床孵育一抗过夜；洗膜；常温摇床孵育二抗，再次洗膜；根据凝胶成像结果检测p-AKT、AKT及BCL-2蛋白表达量，图片数据用Image J及GraphPad Prism 5.0软件处理。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 流式细胞仪检测凋亡结果

lmna基因的下调可引起细胞凋亡，且细胞早期凋亡更明显(P<0.01)(图1,2)。

2.2 蛋白质免疫印迹结果

p-AKT：野生型组较显微注射后24和72 h组低，且显微注射72 h组较24 h组高(P<0.01)；AKT：野生型组较显微注射后24和72 h组低，且显微注射24 h组较72 h组高(P<0.05)；BCL-2：野生型组较显微注射后24和72 h组高(P<0.05)(图3～5)。

图1 野生型、注射lmna-MO后24及72 h胚胎细胞凋亡情况Fig 1 Apoptosis of wild type embryo cells, 24 and 72 hours embryo cells after microinjection of lmna-MO

*P<0.05,**P<0.01 compared with wide type图2 斑马鱼胚胎早、晚期细胞凋亡情况统计图Fig 2 Statistical graph of apoptosis in zebrafish embryos at early and late n=3)

*P<0.01 compared with wide type图3 Western blot检测p-AKT蛋白的表达Fig 3 Expression of p-AKT protein by Western n=3)

*P<0.05 compared with wide type图4 Western blot检测AKT蛋白的表达Fig 4 Expression of AKT protein by Western n=3)

*P<0.05 compared with wide type图5 Western blot检测BCL-2蛋白的表达Fig 5 Expression of BCL-2 protein by Western n=3)

3 讨论

本实验以斑马鱼作为研究对象，其体外受精、易繁殖等优势为研究生物早期组织器官的发育提供了便利[7-8]。吗啉代寡核苷酸技术的原理是基于RNA的核糖骨架被吗啉环替代，从而抑制基因表达，但该技术存在时效短这一缺点：将lmna-MO注射入斑马鱼单细胞期胚胎中，其荧光从6 h在胚胎内广泛表达，至30 h时逐渐减少，72 h则完全消失[3]。本实验结果检测到不同时相的胚胎存在不同程度的凋亡现象，注射lmna-MO 72 h后，胚胎细胞凋亡情况仍明显，说明lmna下调引起细胞凋亡存在不可逆趋势。

lmna基因的缺失可引起细胞迁移和细胞凋亡异常[9]，细胞膜中的磷酯酰丝氨酸(PS)在凋亡早期会由脂膜从内翻向外，暴露的PS与凋亡细胞膜结合的同时可被Annexin V检测到，PE作为荧光素将对Annexin V标记，通过7-AAD标记的DNA降解情况进行流式细胞学分析：LMNA基因的下调可引起细胞凋亡，且细胞早期凋亡更明显，故细胞凋亡现象可能与lmna-MO的暴露时间及胚胎发育情况有关。

Western blot检测到lmna基因下调后p-AKT(S473)表达增加，表明激活的AKT使底物蛋白特定部位的丝氨酸、苏氨酸磷酸化，p-AKT在抑制细胞凋亡促进细胞存活过程中起到了至关重要的作用。p-AKT蛋白与AKT蛋白表达量无正相关性，可能是由于药物暴露时间越长，AKT通路活化程度越高，抑制凋亡程度越明显；但是也不能排除存在其他调控机制参与AKT活化过程。

AKT位于多条重要信号通路的交叉点，能够作用于下游关键的蛋白BCL-2,BCL-2的过度表达可抑制凋亡过程的发生[10-12]。大量研究表明：AKT通路对细胞凋亡有抑制作用,AKT作为BCL-2的上游，对BCL-2蛋白有抑制作用， 从而抑制细胞凋亡。

本实验结果表明：当lmna基因突变后，lmna蛋白表达消失，BCL-2作为lmna上游，由于缺乏下游受体蛋白，故BCL-2蛋白表达减少；AKT通路抑制BCL-2蛋白表达减少，故AKT蛋白表达增加。BCL-2蛋白虽然在线粒体上表达，但是仍可以通过AKT通路和一系列信号蛋白的参与来影响核纤层蛋白的表达(图6)。

lmna可能在调控细胞的凋亡过程中起着重要的作用，p-AKT参与AKT通路激活过程，且lmna引起细胞凋亡机制可能与AKT、BCL-2蛋白的表达情况有关。迄今为止，lmna突变导致细胞凋亡的机制仍然有许多学者在进行研究，但是核纤层蛋白病的潜在分子机制仍亟待解释。

图6 与核纤层蛋白相关的AKT通路Fig 6 lmna and AKT pathway