miR-26b对宫颈癌细胞系迁移及上皮间质转化的影响

凌 燕，彭诗维，冯紫雯，龚剑红*

(1.江西省人民医院 妇产科，江西 南昌 330006； 2.南昌县妇幼保健院 妇产科，江西 南昌 330200)

已有研究显示，成熟的microRNA与肿瘤的发生发展密切相关，影响肿瘤细胞的増殖、迁移、侵袭以及上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)过程[1-2]。宫颈癌是一种比较常见的妇科肿瘤，在女性肿瘤的发生中，其发病率排名第二，仅次于乳腺癌。近年来，中国恶性宫颈癌发病率呈逐年上升，但治愈率比较低，主要原因是其发病的分子机制不十分清楚。miR-26b在宫颈癌组织中呈现低水平表达[3]，且与一些肿瘤的发生、发展密切相关，如肝癌、肠癌以及胶质瘤等[3-5]，然而有关其在宫颈癌疾病的作用及其分子机制尚不清楚。本研究拟将miR-26b mimic转入人宫颈癌细胞系中，观察miR-26b对宫颈癌细胞迁移及上皮间质转化的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、Caski和C33A (中国科学院上海细胞库)； Trizol和脂质体转染试剂LipofectaminTM2000(Invitrogen公司)； miRNA 26b mimic和无义scramble miRNA(上海吉玛公司)；反转录和荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)；E-cadherin和N-cadheri抗体(Cell Signaling Technology公司)；HRP标记的二抗(北京中杉金桥公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染： 宫颈癌细胞系经解冻后，培养于含 10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，细胞增殖至60%～80%汇合时，按说明书进行转染。实验分为阴性对照组(仅加入相应剂量的培养液)、scramble miRNA组和miRNA 26b mimic组。

1.2.2 RT-qPCR：按说明书提取总RNA后反转录得到cDNA， ABI 7500型PCR仪检测基因的表达水平。以U6 snRNA作为对照，通过2△△CT法来计算目的基因的表达。miR-26b和U6 snRNA引物参照以前发表文章[3]。其他基因引物:CXCL14上游引物：5′-GGACGGGTCCAAATGCAA-3′, 下游引物：5′-ACGTCGCTGTAGCGGATCTT-3′； Smad4上游引物：5′-CCCAAGACAGAGCATCAAAGAA-3′, 下游引物：5′-GGGCCCGGTGTAAGTGAAT-3′； TRAF5上游引物：5′-TGGGCCGGTACCAGGAT-3′, 下游引物：5′-TCATTAGAACACTGCACAGGTTGA-3′； EphA2上游引物：5′-CCAGTTCAGCCACCACAACA-3′, 下游引物：5′-CATGGGCTTGTATTTGGAGATG-3′。

1.2.3 细胞划痕实验: 将细胞种植于24孔培养板，待细胞增殖至80%～90%时，用20 μL枪头于底部平行于标记线划痕，PBS清洗脱落的细胞。然后放入 37 ℃、5% CO2培养箱培养，分别在0和24 h拍照，计算划痕损伤面积愈合率。

1.2.4 Western blot:用RIPA液裂解细胞，16 099×g离心10 min，收集上清液，测定蛋白质的浓度，将20 μg蛋白质上样于4%浓缩胶，经12%分离胶电泳后，转膜至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃状态下将PVDF膜与一抗孵育过夜。PBS洗膜3次，洗膜后加入二抗，在室温状态下孵育 1 h，最后显色，通过Quantity One凝胶吸光度分析软件测定其吸光度值，以actin作为内参蛋白。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测实验: 为了检测Smad4是否为miR-26b的直接下游靶基因，采用双荧光素酶报告分析。首先扩增出包含有 miR-26b保守性结合位点3′UTR-WT(野生型) 及3′UTR-MT(突变型)。扩增产物行凝胶电泳，然后将目的基因切胶回收，再将目的基因与质粒载体 pmiR-report Luciferase相连接，构建pGL3-Smad4-3′-UTR-WT和pGL3-Smad4-3′-UTR-MT载体，将重组质粒和miR-26b mimic共同转染细胞，最后用双荧光素酶基因报告检测仪检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 4种宫颈癌细胞系中miR-26b mRNA的表达

与正常宫颈上皮细胞相比，miR-26b mRNA在HeLa、SiHa、Caski和C33A 4种宫颈癌细胞系中均为低表达(图1)，其中以C33A细胞系最为明显(P<0.01)，故以下实验选用C33A细胞系作为转染的细胞模型。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group图1 实时定量PCR检测miR-26b mRNA在4种宫颈癌细胞系的表达Fig 1 Expression of miR-26b mRNA in cervical cancer cell lines by quantitative PCR analysis

2.2 miR-26b mimic成功转染C33A

miR-26b mimic组中miR-26b mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.01)(图2)。

*P<0.01 compared with negative control group图2 实时定量PCR分析miR-26b mRNA在C33A细胞系的表达水平Fig 2 Expression of miR-26b mRNA in C33A cell line by quantitative PCR analysis n=3)

2.3 miR-26b对细胞划痕迁移的影响

细胞划痕培养24 h后，转染miR-26b mimic，C33A细胞的划痕损伤面积愈合率为30.23%±8.14%，显著低于对照组的89.71%±6.73%(P<0.01)(图3)。

2.4 miR-26b对C33A细胞系中EMT标志蛋白表达的影响

转染48 h 后，与对照组相比，miR-26b mimic组中E-cadherin蛋白的表达水平明显上升, N-cadherin表达水平明显下降(P<0.01)(图4)。

2.5 miR-26b对潜在的靶基因表达水平的影响

转染24 h后，与对照组相比，miR-26b mimic组中Smad4 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),而CXCL14、TRAF5和EphA2 mRNA表达水平无明显变化(图5)。

2.6 上调 miR-26b 表达后双荧光素酶相对活性的改变

与对照组相比，pGL3-Smad4-3′-UTR-WT与miR-26b mimic共转染细胞48 h 后，荧光素酶相对活性明显下降(P<0.01)；而pGL3-Smad4-3′-UTR-MT与miR-26b mimic共转染组的荧光素酶相对活性无明显变化(图6)。

3 讨论

在肠癌、肝癌、骨肉瘤及宫颈癌组织中，miR-26b表达水平明显下降，转染miR-26b的类似物可明显抑制肠癌细胞的转移[3-6]。此外， miR-26b-5p可通过作用于SMAD1蛋白，抑制肝癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化过程[5]。在骨肉瘤细胞中，miR-26b通过下调PFKFB3的表达，抑制其增殖、迁移和侵润[6]。这些结果提示，宫颈癌组织中miR-26b表达水平的下降可能增强宫颈癌细胞的转移能力及EMT的发生。为了探讨miR-26b在宫颈癌组织的发生和转移中作用，本研究选用了miR-26b表达水平最低的C33A细胞系作为研究对象，其呈现HPV16阳性，具有较强的侵袭能力。通过转染miR-26b类似物，可明显抑制C33A宫颈癌细胞系的迁移和EMT的发生。因此，正常组织中miR-26b的表达有利于防止肿瘤的形成以及肿瘤细胞的迁移和侵袭的发生。

图3 划痕实验分析miR-26b对C33A细胞系迁移的影响Fig 3 Effect of miR-26b on the migration of C33A cell line by scratch-wound assay(×100)(scale bar=50 μm)

A.representative immunoblotting images of E-cadherin and N-cadherin; B,C.densitometric values from Western blot analyses of E-cadherin (B) and N-cadherin(C); *P<0.01 compared with negative control group图4 Western blot检测miR-26b对C33A细胞系E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响Fig 4 Effect of miR-26b on the expressions of E-cadherin and N-cadherin in the C33A cell line by the Western blot assay n=3)

*P<0.01 compared with negative control group图5 实时定量PCR分析转染miR-26b对其预测靶基因表达水平的影响Fig 5 Effect of miR-26b mimic on the expression of predicted target genes via quantitative PCR

*P<0.01 compared with negative control group图6 miR-26b对双荧光素酶相对活性的影响Fig 6 Effect of miR-26b on the relative luciferase activity in C33A cell n=3)

EMT指的是上皮细胞在形态学上向间质细胞表型的转变。同时，伴随上皮细胞标志物的下降(如E-cadherin)，而间质细胞标志物的明显上升(如vimentin、N-cadherin等)，从而导致细胞间的连接下降，肿瘤细胞的迁移、侵袭及转移能力明显增强[7]。最近，有研究显示miRNA也参与了EMT过程，如miR-132/212可通过调节前列腺癌细胞SOX4表达抑制TGF-β诱导EMT的形成[8-9]。miR-132 通过调节TGFβ1/Smad2的表达抑制非小细胞肺癌的迁移、侵袭以及EMT的发生[10]。本研究显示，过表达miR-26b可明显促进E-cadherin蛋白表达，而下调N-cadherin表达水平，从而抑制C33A宫颈癌细胞系EMT的形成。

为了进一步探讨miR-26b作用的机制，通过TargetScan、PicTar和miRDB 3个miRNA靶其因预测的软件及相关研究，推测CXCL14、Smad4、TRAF5和EphA2可能为miR-26b的潜在靶基因。双荧光素酶实验证实， miR-26b仅作用于Smad4基因3′UTR端，调节靶蛋白Smad4表达。已有研究显示，在EMT发生过程中，主要的信号途径为TGF-β2/Smad、Wnt/β-catenin、Notch等信号通路，其中TGF-β2/Smad是最主要促进ETM发生的主要途径，可分为Smad依赖通路和非Smad依赖通路[8,10]。本研究显示，miR-26b主要依赖Smad通路来调节宫颈癌细胞EMT的发生，转染miR-26b后抑制Smad4蛋白表达，影响Smad三聚体的形成，从而促进EMT形成。在晶状体EMT发生过程中，miR-26b通过调节Smad4和COX-2表达，从而促进上皮细胞EMT的发生[11]。总之，本研究提示，miR-26b可能通过调节Smad4基因的表达，影响宫颈癌细胞的迁移和EMT发生，这将为宫颈癌的靶向治疗提供新的线索。