SOX2和CTBP1相互作用对非小细胞肺癌转移的意义

居冠军，施民新*，陆海敏，毛清华，许 峰，汪志文，薛 群

(1.南通大学附属肿瘤医院 胸外科， 江苏 南通 226361；2.南通大学附属医院 胸外科， 江苏 南通 226001)

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，在许多国家，肺癌已经是癌相关性死亡的最主要的原因[1]。SOX(SRY-like HMG box)是一类具有特征性HMG(hight mobility group, HMG)DNA结合区域的转录因子家族。作为癌基因，SOX2在多种癌组织包括胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和神经内分泌性癌表达增高并发挥促癌作用[2]。

羧基末端结合蛋白(COOH-terminal binding protein，CTBP)是由CTBP1基因和CTBP 2基因分别编码产生的CTBP1和CTBP2两种蛋白[3]。CTBP1在促进上皮间质转换中有重要作用，并抑制黏附分子E-cadherin的表达，肿瘤细胞间的黏附减少，更容易发生转移，这点已在多种肿瘤中被证实[4]。在非小细胞肺癌中，CTBP1通过多种途径参与到肺癌的发生发展过程，并促进肿瘤细胞的转移[5-6]。然而目前的研究并未指出CTBP1促进肿瘤转移的具体机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本：本组非小细胞肺癌石蜡标本114例及新鲜配对组织标本，均由南通市肿瘤医院提供。标本来自2013年7月至2015年7月在南通市肿瘤医院胸外科所实行的肺癌根治术，术前未行放化疗。病理诊断明确，临床病理资料完整。年龄39～77岁；肺癌直径<3 cm 55例，≥3 cm 59例；组织学高分化13例，中分化76例，低分化25例；鳞癌54例，腺癌43例，其他类型癌17例。新鲜配对组织标本8对，新鲜组织离体后冻存于液氮中，随后保存于-80 ℃冰箱内，以便提取组织蛋白。本研究经南通市肿瘤医院医学科学研究伦理委员会批准，并取得所有涉及此项研究患者的知情同意。

1.1.2 细胞及试剂：人类肺癌细胞系H1299(中国科学院细胞库上海保藏中心)；兔抗人SOX2、CTBP1、Snail多克隆抗体(Abgent公司)；兔抗人GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz公司)；Envision免疫组化检测试剂盒(GBI公司)，含有Polymer Helper(即用型，试剂1)、HRP标记的小鼠抗兔IgG(即用型，试剂2)。本研究中所使用的siRNA由上海吉玛基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western blot 检测SOX2、CTBP1、Snail蛋白表达：按照蛋白裂解液说明书提取组织蛋白，测定蛋白浓度，加入4×蛋白上样缓冲液混匀，沸水处理6 min，快速降至室温后上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳。浓缩胶浓度5%，恒压80 V，分离胶浓度10%，恒压120 V。分离胶上的蛋白质通过转移槽转移到PVDF膜。在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中室温下封闭约2 h 后，加入一抗，4 ℃摇动孵育过夜。TBST 洗涤10 min×3次，加入二抗，室温下孵育约2 h，注意全程避光，TBST 洗涤10 min×3次。最后电化学发光法曝光、显影。应用Odyssey成像仪软件分析蛋白条带的吸光度值，以目的蛋白/GAPDH比值表示蛋白的相对表达水平。

1.2.2 免疫组化检测SOX2、CTBP1、E-钙黏蛋白及波形蛋白的表达与分布情况：用Envision免疫组织化学染色方法观察114例非小细胞肺癌的标本中SOX2、CTBP1、E-钙黏蛋白及波形蛋白的表达与分布情况。CTBP1以细胞质内出现黄色颗粒为阳性，SOX2以细胞核内出现黄色颗粒为阳性。对CTBP1和SOX2的染色评估采用半定量评分法。染色强度评分：0分(无着色)，1分(淡黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色)。CTBP1阳性细胞率评分：0分(<10%)，1分(10%～30%)，2分(30%～50%)，3分(50%～70%)，4分(>70%)。SOX2阳性细胞率评分：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(25%～45%)，3分(45%～60%)，4分(>60%)。免疫反应评分(IS)=阳性细胞率评分×染色强度评分。IS 0～4分为低表达组，IS 5～12分为高表达组。

1.2.3 免疫沉淀、细胞转染及划痕实验：具体方法参考既往文献描述[7-8]。

1.3 统计学分析

对不同类的肺癌之间的比较采用单因素方差分析，采用χ2检验CTBP1在非小细胞肺癌中的表达及其与患者相应的临床病理参数之间的关系。所有统计分析采用SPSS19.0软件进行。

1.4 吸光度值分析

通过电脑辅助图像分析系统测定条带的吸光值，并通过GAPDH对各蛋白的表达进行标准化。对照组和实验组之间的相对差异进行了计算。各实验至少重复了3次。

2 结果

2.1 SOX2及CTBP1在8对人NSCLC癌及癌旁非肿瘤组织中的表达

在NSCLC组织中SOX2与CTBP1的表达水平较相应的癌旁组织高(P<0.05)(图1)。

2.2 SOX2和CTBP1在人NSCLC组织及细胞中相互作用

SOX2和CTBP1在NSCLC组织和H1299细胞中存在相互作用(图2)。

2.3 SOX2、CTBP1、E-钙黏蛋白和波形蛋白在人NSCLC转移及非转移组中的表达

SOX2、CTBP1在非小细胞肺癌组织中的表达要高于癌旁的肺癌组织；与非转移组相比，转移组SOX2、CTBP1、vim的表达要高，而E-cad表达相对较低(图3)。

N.paraneoplastic; T.tumor; *P<0.05 compared with paraneoplastic tissues图1 SOX2与CTBP1在NSCLC癌及癌旁非肿瘤组织中的表达Fig 1 Expression of SOX2 and CTBP1 in NSCLC tissues and corresponding paraneoplastic n=8)

A.interaction between SOX2 and CTBP1 in H1299 cells； B.interaction between SOX2 and CTBP1 in fresh NSCLC tissues图2 SOX2与CTBP1的相互作用Fig 2 Interaction between SOX2 and CTBP1

A.the non-metastasis group of lung adenocarcinoma(×40, left; ×200, right), SOX2 and CTBP1 were negative or weakly positive, E-cad was strongly positive, Vim positive;B.the metastasis group of lung adenocarcinoma(×40, left; ×200, right), SOX2 and CTBP1 were strongly positive, E-cad was negative, Vim strong positive; C.the non-metastases group of lung squamous cell carcinoma(×40, left; ×200, right), SOX2 and CTBP1 were negative, E-cad was positive, Vim positive; D.the metastases group of lung squamous cell carcinoma(×40, left; ×200, right),SOX2 and CTBP1 were strongly positive, E-cad was negative, Vim strong positive

图3免疫组化检测在转移和未转移非小细胞肺癌中SOX2和CTBP1的表达

Fig3ExpressionofSOX2，CTBP1inmetastaticandnon-metastaticNSCLCtissuesbyinmmunohistochemicalstain(×40，×200)

2.4 CTBP1表达与NSCLC临床病理参数的相关性

CTBP1的表达水平与临床分期(P<0.001)、组织分化程度(P<0.001)、SOX2表达(P<0.001)、Ki67表达相关(P<0.001)，CTBP1的表达与年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、吸烟情况之间没有明显关系。

2.5 SOX2与CTBP1相互作用的调节机制

在H1299细胞中，转染CTBP1-shRNA-3的干扰效率最高。转染到H1299细胞72 h，提取细胞蛋白，Western blot检测CTBP1的表达降低，SOX2及其下游靶基因Snail的表达也降低(图4)。

图4 通过Western blot检测干扰后CTBP1、SOX2及其下游靶基因Snail的表达Fig 4 Expression of CTBP1, SOX2 and its downstream target gene Snail in H1299 cells after interference by Western blot

2.6 通过干扰CTBP1的表达使肺癌细胞的迁移能力下降

shRNA干扰CTBP1的表达后，通过划痕实验发现，在H1299细胞中，与对照组相比，转染组H1299细胞体外迁移能力受到抑制(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with control group图5 在H1299细胞中干扰CTBP1的表达能降低细胞的迁移能力Fig 5 Interfering with the expression of CTBP1 can reduce cell migration in H1299 cells

3 讨论

上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是让肿瘤细胞获得迁移能力的重要一环，在上皮间质转换过程中发现转录因子Snail的表达上调，而上皮标志物E-cadherin等表达下调[9]。EMT相关转录因子Snail等过表达之后可促进癌的转移过程，表明EMT对癌转移过程具有重要的调控作用[10]。本课题对SOX2和CTBP1的研究也是基于这一点。

在本研究中，首先发现在NSCLC细胞及组织中SOX2与CTBP1能形成复合物。免疫印迹检测CTBP1及SOX2在肿瘤中是高表达的。其次，在114例石蜡切片中通过免疫组化检测CTBP1的表达情况及其与临床参数的关系，显示SOX2和CTBP1在非小细胞肺癌的转移组中表达明显比非转移组高，与间质细胞标志物vim的表达趋势一致。CTBP1的表达水平与肿瘤组织分化程度、临床分期、SOX2表达及Ki-67表达相关。此外，敲低CTBP1可明显抑制SOX2的表达，并导致SOX2信号通路下游靶基因Snail的表达降低。最后，以siRNA干扰CTBP1的表达，通过划痕实验发现肺癌细胞的迁移能力有所下降。这样的CTBP1-SOX2高表达存在方式可能是NSCLC发生发展的一种常见方式，进而可能影响到NSCLC的生物学功能。

SOX2可通过EMT机制促进肺癌转移[11]。进一步对SOX2在肿瘤EMT的研究发现，SOX2能结合在Snail的启动子区域，促进这些基因的表达，并且显著地抑制上皮标志物E-cadherin表达，从而促进上皮间质转换和肿瘤的转移[2]。SOX2的HMG区域可以作为潜在的蛋白伴侣分子的结合位点，以及SOX2的乙酰化位点，可以调节SOX2的出入核转位、乙酰化及泛素化降解，当SOX2乙酰化受阻时，SOX2不能出核被降解，在核内持续表达，促进下游信号传递[12]。已有研究发现CTBP1在低氧环境下能够与其他蛋白质形成转录抑制复合物，增强组蛋白脱乙酰基酶的活性，促进组蛋白的去乙酰化[13]。因此推测，在肿瘤持续增殖所造成的局部微环境缺氧刺激下，CTBP1被诱导形成转录抑制复合物，与SOX2相互作用，促进SOX2的去乙酰化，抑制其出核降解，并持续激活下游靶基因Snail的表达，促进肺癌的EMT及肿瘤转移。因此在下一步的研究中应深入研究CTBP1调节SOX2的机制，进一步验证SOX2和CTBP1的相互作用，对下游的影响以及对EMT的作用。