乌司他丁下调脂多糖诱导小鼠急性肺损伤肺组织中miR- 21表达
2018-08-08程黎，杨平
程 黎，杨 平
(重庆市急救医疗中心, 重庆 400010)
遏制早期过度和失控的炎性反应被认为是控制急性肺损伤(acute lung injury，ALI)发生发展的关键[1]。新近发现miR- 21可参与组织的炎性反应调控。应用基因芯片技术研究发现炎性肠病患者中miR- 21表达增高，且与炎性活动密切相关[2- 3]；气道炎性反应小鼠中miR- 21亦呈高表达[4]。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)基因是miR- 21的重要靶基因，干扰PDCD4表达后促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)产生增多，提示PDCD4有抗炎作用[5]。而乌司他丁(ulinastatin,UTI)可下调miR- 21表达发挥对深低温体外循环ALI保护作用[6]。因此，推测UTI能通过下调miR- 21而增加肺部PDCD4的表达，减少炎性因子的释放。
本研究旨在通过动物实验探讨miR- 21在ALI中的作用，并丰富对UTI减轻炎性反应作用机制的认识。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：40只SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，[重庆医科大学动物实验中心，合格证号：SCXK(渝)2012- 0001]，实验前适应性饲养1周。
1.1.2 试剂：LPS(Sigma公司)；UTI(广东天普生化医药公司)；microRNA及总RNA提取试剂盒(Biotake公司)；反转录试剂盒及MiScriptⅡRT-qPCR SYBRGreen Kit(TaKaRa公司)； RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒及Western blot配胶试剂盒(碧云天生物技术研究所)；髓过氧化物氧化酶(myeloperoxidase，MPO)检测试剂盒(武汉基因美生物科技公司)；ELISA试剂盒(北京四正柏生物科技公司)；兔来源多克隆β-actin抗体和HRP-羊抗兔二抗(武汉三鹰生物技术公司)；PDCD4多克隆抗体(BIOSS公司)。
1.2 方法
1.2.1 小鼠分组及处理：将小鼠按随机数字表分为对照组(control group)、LPS组(LPS group)以及低和高剂量乌司他丁干预组(UTI-L group，UTI-H group)，每组10只。以3 mg/kg质量经插管气道内滴入LPS(1 μg/μL)建立ALI模型，建模即刻UTI按5×104U/kg和1×105U/kg腹腔内注射给药。
1.2.2 小鼠肺组织病理切片染色并观察病理改变:造模后72 h，取右上肺组织，4%多聚甲醛固定，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)，光镜观察。
1.2.3 W/D值：小鼠肺湿干重比(W/D)造模后72 h，取肺组织称重后置于60 ℃烤箱48 h至恒重，再称重，计算W/D值。
1.2.4 MPO活性：小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)常规收集BALF 4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，计数粒细胞、测定蛋白、IL- 1β、TNF-α含量和MPO活性。
1.2.5 Western blot测小鼠肺组织PDCD4的蛋白水平：按试剂盒要求提取小鼠肺组织蛋白，BCA法测所提取蛋白浓度，聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，湿转法转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗PDCD4(1∶500)或β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP-羊抗兔二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL法显像，Quantity One软件分析条带吸光度值。
1.2.6 qPCR测小鼠肺组织miR- 21及PDCD4 mRNA表达水平：按试剂盒说明书提取总RNA，按RNA PCR Kit说明书进行反转录操作将RNA反转录为cDNA，以此为模板进行PCR扩增。miR- 21的上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAG ACTGATG-3′，下游引物为5′-CTTAACGGCTGAGGT GCTGT-3′；内参U6的上游引物为5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，下游引物为5′-TGCGTTTAAGCACT TCGCAA-3′；PCR反应条件：94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环。PDCD4的上游引物为5′-AACTATGATGACGACCAGGAGAAC-3′，下游引物为5′-CCACAACCGTCACAGGAATCG-3′；内参GAPDH的上游引物为5′-AGGTTGTCTCCTGCGA CTTCA-3′，下游引物为5′-TCG TTGTCTCACCACCTG GAG-3′；PCR反应条件：95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环。用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 肺组织病理改变
LPS组72 h可见大量炎性细胞浸润，肺泡间隔水肿增厚明显；UTI-L组中等量炎性细胞浸润，肺泡间隔水肿中度增厚； UTI-H组少量炎性细胞浸润，肺泡间隔水肿轻度增厚(图1)。
2.2 肺组织W/D值变化
与对照组比，LPS组72 h W/D值明显增高(P<0.05)，UTI处理组W/D值较LPS组明显降低(P<0.05)，且与UTI剂量相关(图2)。
2.3 BALF的粒细胞计数、总蛋白含量、IL- 1β、TNF-α含量及MPO活性
与对照组比较，LPS组粒细胞计数显著增高，同时伴总蛋白含量、IL- 1β、 TNF-α含量及MPO活性升高，UTI干预后粒细胞计数回落，总蛋白含量、炎性细胞因子及MPO活性降低， UTI的保护作用与其剂量密切相关(图2)。
A.control group; B.LPS group; C.UTI-L group; D.UTI-H group图1 各组小鼠肺组织病理改变Fig 1 Pathological changes in the lung tissues(×200)
2.4 UTI干预后对小鼠肺组织miR- 21和PDCD4表达的影响
与对照组比较，LPS组肺组织中miR- 21表达明显增高，PDCD4蛋白水平明显下降，UTI干预后miR- 21表达降低明显，PDCD4蛋白水平显著增高，且增高水平与UTI剂量相关，而PDCD4 mRNA在UTI干预前后无明显变化(图3)。
*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with LPS group;△P<0.05 compared with UTI-L group
图2肺组织湿/干重比及BALF中PMN计数、总蛋白含量、IL-1β、TNF-α含量和MPO活性测定
*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with LPS group; △P<0.05 compared with UTI-L group图3 肺组织中miR- 21、PDCD4 mRNA及PDCD4蛋白水平的测定
3 讨论
ALI是临床常见的危重症之一，以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润、肺间质和肺泡内肺水肿等多种急性炎性反应相关的表现是其主要的病理学改变，自我放大失控的炎性反应被认为是ALI发病中心环节。采用LPS复制ALI动物模型是较理想且常用的方法，本实验结果显示，与对照组比较，LPS组病理切片发现肺间质大量中性粒细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，评估肺水肿的指标W/D值增高，BALF中PMN计数、蛋白及IL- 1β、TNF-α含量，MPO活性明显增高，炎性反应明显，符合ALI时肺组织损伤的特点，是合格的动物模型。
UTI是一种抑酶谱广泛的蛋白酶抑制剂，可抑制糖、脂质水解酶及多种蛋白酶的活性，同时改善中性粒细胞及巨噬细胞导致的组织损伤[7- 8]。本实验发现UTI干预后小鼠肺组织炎性反应减轻、W/D值下降、BALF中PMN计数、蛋白及IL- 1β、TNF-α含量及MPO活性明显降低，改善程度呈剂量相关性。与既往研究结果[9]一致，UTI可以减轻和抑制LPS导致的肺组织的炎性反应。
近来研究发现miR- 21在调控免疫炎性反应中有重要作用[10]，它可以减少对蛋白激酶B的抑制，进而减少对与炎性反应密切相关的NF-κB的抑制，促进炎性反应[11]。实验发现，ALI时肺部炎性反应的加重伴随着miR- 21水平增高，给予UTI干预后，ALI时肺组织炎性反应改善的同时伴随着miR- 21水平降低，且降低程度与UTI干预剂量密切相关，提示UTI对ALI肺炎性反应保护作用可能是通过调控miR- 21发生的。
PDCD4是miR- 21调控的靶基因[12]，主要为转录后负调控蛋白的表达。目前发现PDCD4同样参与某些炎性疾病的发生发展[13]。在RAW264.7细胞系中，下调PDCD4可以促进LPS诱导的促炎细胞因子产生，提示PDCD4有抑炎作用[14]。实验发现在不同剂量UTI干预后，miR- 21表达下调伴随着其靶蛋白PDCD4含量增加。但PDCD4 mRNA的相对表达量却无明显变化，PDCD4 mRNA与蛋白表达不同步可能与miRNA在转录后水平抑制mRNA的翻译而不降解mRNA的调控机制有关[15]。
综上所述，乌司他丁能下调miR- 21的表达，增加其靶蛋白PDCD4表达，从而发挥对LPS诱导的ALI的炎性保护作用。本实验不足之处是未深入研究乌司他丁调控miR- 21的具体机制。
