长链非编码RNA BANCR在胃癌细胞中的表达变化及对AGS细胞增殖、迁移能力的影响

马松林，徐丹，王剑，孙圣斌，吴杰

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院，武汉430000)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，易转移复发，患者5年总生存率不到30%[1～3]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA[4]。研究[5]表明，lncRNA可在肿瘤的多种生物学过程如增殖、凋亡和免疫应答等方面起关键作用。lncRNA BANCR与多种肿瘤细胞的生长和转移相关，包括视网膜细胞瘤[6]、肺癌[7]、黑色素瘤[8]等，但其在胃癌中的作用鲜有报道。本研究观察了lncRNA BANCR在胃癌细胞中的表达变化，及其对细胞增殖、迁移能力的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 胃癌细胞AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T及正常胃黏膜上皮细胞GES-1均购自美国ATCC细胞库。核转录因子NF-κB1两个亚基p50、p105及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)一抗均购自Invitrogen公司，二抗购自美国BD公司。RPMI1640培养基、RT-PCR仪购自美国BD公司。HBS-1096B酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司。蛋白免疫印迹电泳设备购自美国Bio Rad公司。

1.2 胃癌细胞中lncRNA BANCR检测 AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T细胞及GES-1细胞均接种于RPMI1640培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后消化传代。提取并分离细胞的RNA，采用NanoDrop1000分光光度计对RNA的浓度进行测定，采用RT-PCR法检测细胞中的lncRNA BANCR。lncRNA BANCR上游引物序列为5′-GAATTGCGTCATTTAAAGCCTAGTT-3′，下游引物序列为5′-GTTTCATCCTACCACTCCCAATTAAT-3′；内参GAPDH上游引物序列为5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列为3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。以2-ΔΔCt表示lncRNA BANCR的相对表达量。

1.3 lncRNA BANCR表达变化对AGS细胞增殖、迁移能力的影响观察

1.3.1 AGS细胞分组及lncRNA BANCR沉默方法 取AGS细胞分成LV-BANCR shRNA组、LV-NC组及BLANK组，用Lipofectamine2000分别转染pcDNA3.1-LV-BANCR shRNA(上游引物序列为5′-GGTCUTCTCUTTGCTCTUTCC-3′，下游引物序列为5′-GGUUUGUGCUUUGUGUUGUCC-3′)及pcDNA3.1-LV-NC shRNA(上游引物序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列为5′-UCGTGUCUCGTTCGGUGUUTT-3′)，BLANK组加入PBS。转染浓度为300 nmol/孔。转染48 h后，LV-BANCR shRNA组、LV-NC组、BLANK组lncRNA BANCR相对表达量分别为0.13±0.06、1.00±0.05、1.00±0.03，LV-BANCR shRNA组lncRNA BANCR相对表达量低于LV-NC组和BLANK组，提示转染成功，可进行下一步实验。

1.3.2 细胞增殖能力检测 MTT法测定三组细胞增殖能力。将LV-BANCR shRNA组、LV-NC组及BLANK组细胞消化成单细胞悬液后，以2×103/孔将细胞种植于96孔板上，每孔上样200 μL，分别于培养0、1、2、3、4 d后加入20 μL的MTT溶液，继续培养1 h后，在490 nm波长下用酶标仪测定OD值表示细胞增殖能力。

1.3.3 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕试验。将LV-BANCR shRNA组、LV-NC组细胞培养于6孔板，待细胞融合后，用灭菌枪头用力划直线。分别于划痕后即刻和48 h在显微镜下观察细胞划痕修复情况，使用Wim Scratch在线图像分析系统测定细胞划痕面积，计算划痕愈合率。划痕愈合率=(划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积)/划痕后即刻的划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。

1.3.4 细胞中NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK检测 采用Western blotting法。将LV-BANCR shRNA组、LV-NC组细胞裂解、变性后，每孔上样30 μg的蛋白；浓缩胶条件为50 min、80 V，分离胶条件为100 min、100 V，常规转膜；加入NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK及GAPDH一抗，抗体浓度为1∶300，于4 ℃孵育过夜；二抗(1∶500)经37 ℃孵育4 h后，PBST漂洗3次；在ECL液下显影，Quantity One 1-D分析目标蛋白灰度值。以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T细胞及GES-1细胞中lncRNA BANCR表达比较 AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T细胞及GES-1细胞中lncRNA BANCR相对表达量分别为1.97±0.11、2.28±0.16、3.76±0.34、5.17±0.29和1.0±0.03，AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T细胞中lncRNA BANCR相对表达量均高于GES-1细胞(P均<0.05)。

2.2 lncRNA BANCR表达变化对AGS细胞增殖能力的影响 培养3、4 d后，LV-BANCR shRNA组OD值小于LV-NC组和BLANK组(P均<0.05)。详见表1。

表1 培养不同时间后各组AGS细胞OD值比较

2.3 lncRNA BANCR表达变化对AGS细胞迁移能力的影响 LV-BANCR shRNA组、LV-NC组划痕愈合率分别为34.51%±2.29%、63.25%±4.73%，LV-BANCR shRNA组划痕愈合率低于LV-NC组(P<0.05)。

2.4 lncRNA BANCR表达变化对AGS细胞中NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK表达的影响 LV-BANCR shRNA组NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK相对表达量分别为0.32±0.03、0.37±0.04、0.46±0.03，LV-NC组分别为1.0±0.04、1.0±0.03、1.0±0.06，LV-BANCR shRNA组NF-κB1 p50、NF-κB1 p105、p-ERK相对表达量均低于LV-NC组(P均<0.05)。

3 讨论

胃癌是种常见的胃肠道恶性肿瘤，具有高致死率、高侵袭转移能力等特点，常见的致病因素包括幽门螺杆菌感染、EB病毒感染等[9]。lncRNA的异常表达是肿瘤进展的重要标志。研究表明，lncRNA BANCR与多种肿瘤发展密切相关，其在肝癌[10]、视网膜母细胞瘤[6]、骨肉瘤[10]中表达明显上调，但是在肺癌[8]中表达显著降低，提示lncRNA BANCR在不同的肿瘤类型中可能起到抑癌或促癌两种截然不同的作用。本研究发现，AGS、BSG823、MGC-803、Hs746T细胞中lncRNA BANCR相对表达量高于GES-1细胞，培养3、4 d后LV-BANCR shRNA组OD值小于LV-NC组和BLANK组，LV-BANCR shRNA组划痕愈合率低于LV-NC组，表明lncRNA BANCR在胃癌细胞中高表达，沉默lncRNA BANCR表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移能力，提示lncRNA BANCR是胃癌的促癌基因。

NF-κB是与肿瘤密切相关的转录因子家族成员之一，在细胞增殖、凋亡、分化、侵袭及肿瘤血管生成和转移中起重要作用。NF-κB由两个亚基形成同源或异源二聚体，并与连接蛋白形成复合体，绑定到应答基因的启动子，由此调控基因转录活性[11]。研究[12]发现，NF-κB1可通过调控基质金属蛋白酶、细胞黏附分子、环氧合酶2和血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤转移和侵袭等过程。细胞周期蛋白D1可受NF-κB1的诱导而参与肿瘤细胞增殖等致癌过程。Liu等[12]发现，miRNA-9通过下调NF-κB1表达，进而抑制黑色素瘤和卵巢癌细胞增殖、转移和侵袭。文献[13]报道B淋巴细胞可通过调控NF-κB亚基Rel和NF-κB1，影响处于静息状态和有丝分裂状态下的细胞周期进程，影响凋亡过程。本研究中，LV-BANCR shRNA组NF-κB1 p50、NF-κB1 p105相对表达量均低于LV-NC组，表明lncRNA BANCR沉默后胃癌细胞中的NF-κB1表达受抑制，推测NF-κB1表达降低削弱了胃癌细胞的增殖、侵袭能力。

研究[14]发现，MAPK信号通路是进化上高度保守的信号途径，可将细胞外信号传导至细胞内及核内，从而引起细胞内响应。ERK是典型的MAPK信号通路分子，当接受上游的级联反应信号后，ERK蛋白受磷酸化而激活，激活后的MAPK/ERK在细胞增殖、分化、血管生成、肿瘤侵袭等生物过程中具有重要作用[15]。在多种恶性肿瘤中(如胃癌、胶质瘤)存在MAPK/ERK信号通路异常激活。目前已有大量研究指出肿瘤细胞的生长、转移与MAPK/ERK途径有紧密关联。Han等[16]发现胶质瘤细胞中lncRNA MALAT1抑癌功能的发挥是由于MAPK/ERK失活及基质金属蛋白酶-2表达下调。还有研究[7,8]指出lncRNA BANCR通过激活MAPK/ERK促进黑色素瘤和肺癌细胞的增殖、转移。本研究结果显示，LV-BANCR shRNA组p-ERK相对表达量均低于LV-NC组，推测lncRNA BANCR沉默后细胞中MAPK/ERK信号通路受抑制，因而减弱了胃癌细胞的增殖、迁移能力。

综上，lncRNA BANCR在胃癌细胞中高表达。沉默lncRNA BANCR表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移能力，其机制可能与NF-κB1 p50、NF-κB1 p105及p-ERK表达下调有关。尽管具体分子机制仍有待于进一步探索，但上述研究结果对于揭示胃癌发生发展的分子机制、开发肿瘤靶向治疗的靶点具有一定意义。