子痫前期患者血清及胎盘组织中VEGF和MMP-9的研究

2018-08-03张久梅

卫生职业教育 2018年14期

王书，张久梅

（1.白银市白银区人口和计划生育服务站，甘肃白银 730900；2.深圳市第二人民医院，广东深圳 518000）

子痫前期或称为先兆子痫，是妊娠期的特发性疾病，在我国的发病率为5%～8%[1]。其发病原因主要可能涉及以下几个方面[2]：血管内皮损伤、滋养细胞侵袭异常、免疫调节功能异常、遗传因素、营养因素等。血管内皮生长因子（VEGF）是一种肝素结合生长因子，对血管内皮细胞具有特异性，能够诱导新血管生长[3]。血液中的VEGF与其受体结合，能够激活细胞内的酪氨酸激酶，继而使下游细胞信号级联启动，从而促使新血管生长[4]，它对着床、胎盘血管形成有重要意义。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一类肽链内切酶，又称明胶酶，主要由滋养细胞、内皮细胞以及结缔组织细胞和某些肿瘤细胞分泌[5]，其主要功能是保持细胞外基质的动态平衡。鉴于上述二者如此重要的生理功能，本研究着力于分析其在孕妇胎盘组织中的表达，揭示二者与子痫前期发生的关系，造福患者。

1 材料

1.1 受试对象

选择2013年1月至2014年12月在兰州大学第一医院进行剖宫产术分娩的子痫前期孕妇81例，其中轻度子痫前期41例（定义为轻度组），重度子痫前期40例（定义为重度组），另外选择相同时期孕足月进行剖宫产术分娩的45例健康孕妇为对照组。按照全国统编教材《妇产科学》第7版分类和诊断标准[6]进行分类。3组孕妇均为单胎，胎儿无畸形；孕妇既往均无严重病史、不良孕产史以及长期服用药物史，各组孕妇都排除内科合并症以及产科并发症。

1.2 主要试剂及来源

VEGF酶联免疫法试剂盒购自上海卡努生物科技有限公司；MMP-9酶联免疫法试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司；免疫组化（SP法）染色试剂盒、鼠抗人VEGF单克隆抗体、山羊抗人MMP-9多克隆抗体均采购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 方法

2.1 血清样本的采集

采集孕妇分娩前清晨静脉血，离心机2 000 r/min离心15分钟，收集血清，于4℃保存，用于检测，样本在收集12小时之内进行实验。

2.2 胎盘样本的收集

剖宫产过程中孕妇胎盘娩出以后，在脐带附着处取组织一块（母体面），面积约1 cm×1 cm×1 cm，无出血钙化，用pH为7.0的无菌PBS冲洗干净，然后放置在4%的福尔马林中，固定24小时以上，然后用石蜡包埋，制成4 μm连续切片。所有样本的获得均取得受试对象与亲属的知情同意。

2.3 血清VEGF、MMP-9的检测

采用VEGF、MMP-9酶联免疫法试剂盒进行检测，具体操作方法参照试剂盒说明书进行。

2.4 免疫组化测定方法

免疫组化的具体步骤[7]参照《病理学技术》及金桥生物SP法试剂盒说明书进行。

2.5 实验室结果判定

在高倍显微镜下（400倍）观察石蜡切片中细胞免疫染色情况，VEGF、MMP-9阳性判定标准为显微镜下细胞核或细胞浆内出现棕黄色细颗粒，对每张切片随机选择3个视野，200个/视野。判断标准参照Birner法[8]。根据阳性细胞染色的强度和细胞显色的比例进行半定量判定。按染色强度评分：染色无0分；染色弱1分；中等染色2分；强染色3分。按阳性细胞百分比评分：阳性细胞数＜10%得1分；阳性细胞数11%～50%得2分；阳性细胞数51%～80%得3分；阳性细胞数＞80%得4分。两种评分结果相加分为 4个等级：阴性（-）：0～1分；弱阳性（+）：2～3分；中阳性（＋＋）：4～5 分；强阳性（＋＋＋）：6～7 分。

3 数据处理

数据用SPSS 20.0统计软件进行处理分析。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用kruskal-wallis H检验、Mann-whitney检验；相关性分析采用Pearson相关分析。以α=0.05作为检验水准，采用origin Pro 8.0作图。

4 结果

4.1 一般资料比较

3组孕妇在年龄、孕周之间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

4.2 3组血清样本中VEGF、MMP-9的检测

表 1 3 组孕妇年龄、孕周比较（x±s）

3组血清样本中VEGF与MMP-9的含量见图1。结果显示：与对照组相比，轻度组与重度组的血清VEGF含量显著性降低（P＜0.05），但轻度组与重度组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，轻度组与重度组的血清MMP-9含量显著性降低（P＜0.05），重度组较轻度组的MMP-9含量显著降低（P＜0.05）。

图13组血清样本中VEGF、MMP-9的含量

4.3 3组胎盘样本中VEGF的表达

3组孕妇胎盘样本中均有VEGF阳性表达，细胞膜和细胞浆是主要表达部位，此外，还有少量的VEGF在绒毛间质中表达，阳性表达染色呈深黄色或黄褐色（见图2）。VEGF在3组胎盘样本中表达强度的比较见表2。表2显示，对照组VEGF阳性表达率95.56%，轻度组VEGF阳性表达率73.17%，重度组VEGF阳性表达率37.50%。轻度组与对照组的VEGF阳性表达率比较，差异有统计学意义（Z=-6.775，P＜0.05），重度组与对照组的VEGF阳性表达率比较，差异有统计学意义（Z=-2.294，P＜0.05），重度组与轻度组的VEGF阳性表达率比较，差异有统计学意义（Z=-2.291，P＜0.05）。

图2 3组胎盘样本中VEGF免疫组化结果

表2 3组胎盘样本中VEGF的表达

4.4 3组胎盘样本中MMP-9的表达

3组孕妇胎盘样本中均有MMP-9阳性表达，轻度组、重度组样本中MMP-9定位与对照组相同，绒毛滋养细胞是主要表达部位，阳性染色都呈现棕色、褐色（见图3）。MMP-9在3组胎盘样本中表达强度的比较见表3。表3显示，对照组MMP-9阳性表达率86.67%，轻度组MMP-9阳性表达率65.85%，重度组MMP-9阳性表达率37.50%。轻度组与对照组MMP-9阳性表达率比较，差异有统计学意义（Z=-1.984，P＜0.05），重度组与对照组MMP-9阳性表达率比较，差异有统计学意义（Z=-2.844，P＜0.05），重度组与轻度组MMP-9阳性表达率比较，差异有统计学意义（Z=-2.437，P＜0.05）。

图3 3组胎盘样本中MMP-9免疫组化结果

表3 3组胎盘样本中MMP-9的表达

4.5 样本中VEGF与MMP-9的相关性研究

调查结果显示：血清VEGF含量与胎盘VEGF表达的相关系数0.897，两者呈正相关（P＜0.05）；血清MMP-9含量与胎盘MMP-9表达的相关系数1.000，两者呈正相关（P＜0.05）；血清VEGF含量与血清MMP-9含量的相关系数0.922，两者呈正相关（P＜0.05）；胎盘VEGF表达与胎盘MMP-9表达的相关系数0.999，两者呈正相关（P＜0.05），具有见表 4。

表4VEGF与MMP-9的相关性

5 讨论

5.1 血清、胎盘样本中VEGF与子痫前期的关系

VEGF是一种功能强大且能产生多种效应的细胞因子[9]，它具有诱导血管生成、提高血管的渗透性、改善血流动力学功能等重要作用。本研究从血清学、组织学、细胞学的角度研究VEGF的表达与子痫前期的关系。分析以上的数据结果可以看出，子痫前期孕妇血清中的VEGF含量显著降低，胎盘组织中VEGF的表达也显著降低，并且随着病情的加重，VEGF的表达降低越多。由此推测VEGF的低表达可能引起子痫前期的发生。在妊娠前期由于VEGF合成和释放减少，影响滋养细胞的增殖与分化，影响了胎盘血管的形成，最终造成子痫前期疾病的发生。另外血清VEGF含量与胎盘VEGF的表达呈现正相关（P＜0.01），由此提示在临床应用中可以通过检测孕妇血清中的VEGF含量来预防子痫前期发生的风险。目前，SFDA已经有批准文号的血清VEGF试剂盒（如威海威高VEGF试剂盒）应用于临床诊断，但是实际应用主要针对肿瘤的检测，依然没有合理的参考水平范围来定义子痫前期的发病，未来随着研究的深入，相信这个问题会得到解决。

5.2 血清、胎盘样本中MMP-9与子痫前期的关系

MMP-9的生理作用广泛，主要功能是保持细胞外基质的动态平衡，例如胚胎发育、繁殖、血管和骨骼发育、伤口愈合、细胞迁移、学习、记忆以及在病理过程中的分解，如关节炎、脑出血以及癌细胞扩散等。MMP-9可能在新血管形成中发挥重要作用，有显著的证据[10]表明，MMP-9对血管生成的重要组分内皮干细胞的形成有重要作用。基于以上研究数据显示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇血清中的MMP-9显著降低，胎盘组织中的MMP-9的表达也显著降低，并且随着病情的加重，MMP-9的降低更加明显。由此推测：胎盘组织MMP-9的表达降低可能也是子痫前期发病机制中的相关因素。在妊娠期，MMP-9的低表达使细胞外基质降解与重塑功能减弱，使血管内皮干细胞生成缓慢，进而影响滋养细胞的增殖与分化、血管的形成，最终造成子痫前期的发生。另外血清MMP-9含量与胎盘MMP-9的表达呈现正相关（P＜0.05），提示在临床应用中可以通过检测孕妇血清中的MMP-9含量来预防子痫前期发生的风险。目前血清MMP-9检测试剂盒均为科研用途，依然没有应用于临床诊断的MMP-9试剂盒。