薄层色谱扫描法测定桑白皮中桑辛素含量△

刘一涵，田云刚，王建霞，向芳芳，魏华，2*

(1.吉首大学 生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.湖南省土家医药研究中心，湖南 吉首 416000)

桑白皮(Mori Cortex)为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，最早记载于《神农本草经》，现为《中华人民共和国药典》2015版收载的常用中药，具有泻肺平喘，利水消肿之功效，主要治疗肺热喘咳，水肿胀满尿少，面目肌肤浮肿[1]。化学成分研究表明，桑白皮中含有Diels-Alder型加合物、黄酮类、二苯乙烯类、2-芳基苯并呋喃类、多羟基生物碱类及其他类的多种化学成分。药理研究表明，桑白皮具有降血压、降血脂、降血糖、镇痛、抗癌、抗HIV、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物等多种药理作用[2-3]。桑辛素(morusin)，也称桑根皮素，是从桑白皮中分离出的一种异戊烯类黄酮，具有抗肿瘤、抗炎[4]、抗氧化、降糖[5]、降血脂[6]、镇痛[7]、抗痉挛[8]、抑胆碱脂酶[9]及其他[10]等多方面的药理活性，是极具开发价值的药物先导化合物和桑白皮中可能的主要指标性成分。近年来，对于桑辛素的含量测定已有部分报道[11-14]，但这些方法中有的代价较大、有的步骤繁琐、有的耗时耗力。因此，为了克服前人分析方法的不足，有必要采用一种灵敏、高效和低廉的分析方法。本研究采用简单、易行的双波长薄层色谱扫描法对不同产地桑白皮中桑辛素的含量进行测定，一方面为桑白皮中桑辛素的质量控制提供了一种新的参考方法，另一方面为桑白皮的综合利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CAMAG SCANNER 3型薄层扫描仪(瑞士卡玛公司)，CAMAG SANMPLER 4型全自动点样仪(瑞士卡玛公司)，CAMAG ADC2自动展开缸(瑞士卡玛公司)，25 μL进样针(瑞士卡玛公司)，AG285电子天平(瑞士METTLER TOLEDO)，不同规格硅胶GF254预制板(青岛海洋化工厂)，LD-4台式离心机(常州天瑞仪器有限公司)，KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BZF 50型真空干燥箱(Boxun)。

1.2 材料

桑辛素对照品自制(纯度达98%以上)。桑白皮药材购买或采集，经吉首大学魏华副教授鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，药材产地见表1。试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称定10.0 mg桑辛素对照品，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成浓度为1 mg·mL-1的溶液，取1 mg·mL溶液1 mL再定容至10 mL，稀释为0.1 mg·mL-1，即为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取桑白皮样品粉末(过60目筛)0.5 g，精密称定，加甲醇，料液比为1∶10，超声波辅助提取30 min，4000 r·min-1离心10min取上清液，此法提取四次，合并上清液、浓缩，甲醇溶解并定容至5 mL，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，滤液备用。

2.3 薄层色谱分离、扫描条件

点样条件：取0.1 mg·mL-1对照品溶液和供试品溶液3 μL于GF254薄层板上条带点样，点样速度：150 nL·s-1，样点宽度：6 mm，点样基线距底边10 mm，样点距边缘20 mm，样点间距为10.6 mm。

层析条件：以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(1.5∶0.8∶1)为展开剂，温度为(25±3) ℃，湿度为50%～55%，展开槽内放饱和滤纸饱和30 min，上行展开，展至约9 cm处。取出晾干后置于UV254 nm下检视，供试品色谱中含有与对照品相应的暗斑，且与其他组分完全分离，可进行定量分析(图1)。

注：R表示桑辛素对照品，1～10样品信息见表1。图1 桑辛素对照品及10批样品薄层色谱图(254 nm)

扫描条件：将层析后的对照品和供试品在200～700 nm范围内扫描，结果二者均在273 nm处有最大吸收(图2)，故选择扫描波长为λS=273 nm，λR=500 nm，狭缝：0.4 mm×0.2 mm，扫描速度：20 mm·s-1，反射式锯齿形扫描。以斑点峰面积随行外标二点法计算含量(图3)。

2.4 精密度试验

同板精密度：取低浓度对照品在同一硅胶板上平行点样6个点，每点均为3 μL，依法展开，晾干，扫描，测得桑辛素含量RSD为1.21%(n=6)，结果表明，同板精密度良好。

表1 10批药材中桑辛素含量测定结果(n=4)

图2 薄层扫描色谱图

图3 对照品及10批样品薄层扫描3D图谱

异板精密度：取低浓度对照品溶液于不同薄层板上各点样3 μL，依法展开，测得桑辛素含量RSD为2.30%(n=6)，结果表明，异板精密度良好。

2.5 检测限和定量限实验

精密吸取对照品适量，在同一薄层板上分别点0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μL，每个点平行3次，依法展开、扫描，进行检测限与定量限测定。分别以信噪比(S /N)为3时和信噪比(S/N)为10时的点样作为检测限和定量限。结果桑辛素的检测限为20 ng，定量限为40 ng。

2.6 线性关系考察

用全自动点样仪点0.1 mg·mL-1对照品溶液2.0、2.5、4.0、6.0、8.0、10.0、10.5、11.0 μL于同一硅胶GF254薄层板上，按上述薄层色谱条件展开，扫描测定，以斑点峰面积积分值Y为纵坐标，对照品点样量X(ng)为横坐标计算桑辛素含量的回归方程：Y=5 814.491+40.320X，r=0.999 1，sdv=2.04%。结果表明，桑辛素点样量在200～1100 ng范围内与峰面积呈良好的线性关系，如图4。

图4 桑辛素的标准曲线图

2.7 稳定性试验

在同一GF254硅胶板上交叉点供试品和对照品，展开，每隔20 min扫描一次，持续2 h，结果表明，桑辛素斑点峰面积值至少在2 h内基本保持不变，RSD=2.10%(n=7)，稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取2号药材5份，各0.5 g，按2.2项供试品溶液制备方法制备，各溶液点样、展开、扫描，测得桑辛素含量RSD为2.80%，表明重复性良好。

2.9 加样回收率实验

精密称定已知含量的药材5份，各0.25 g，精密加入1 mg·mL-1对照品溶液适量，按2.2项下供试品处理方法操作，得回收率供试品，依法测定含量，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率测定结果

2.10 样品含量测定

按2.2项下的方法制备10批桑白皮药材的供试溶液，用全自动点样仪交叉点样对照品和供试品溶液适量，按2.3项下方法展开、晾干、扫描测定10批桑白皮药材中桑辛素的含量。结果见表2。10批样品中桑辛素含量在0.737～1.599 mg·g-1范围内，其中四川绵阳野生样品中桑辛素含量最高，云南栽培样品中桑辛素含量其次，桑辛素含量最高与最低的样品相差超过2倍。

3 讨论

目前，《中华人民共和国药典》2015版中所记载的桑白皮无规定的含量测定指标性成分[1]，而桑辛素具有多种重要的药理作用，且其含量较为可观，因此，有望成为桑白皮中指标性成分之一。已有报道的关于桑白皮中桑辛素含量的测定方法主要有HPLC、UPLC和紫外分光光度法。其中，HPLC和UPLC精密度高，但流动相选择范围较窄，每次只能测定一个样品且分析耗时较长，数据处理较慢；紫外分光光度法操作较为繁琐，耗时长，对其他干扰较为敏感。

本研究采用薄层色谱扫描法测定的桑辛素，其在UV254 nm下可见清晰暗斑，故点样于GF254薄层板上无需显色，可直接定性观察和定量扫描。在耗时约半小时，于20 cm×10 cm薄层板上可一次性成功分离、鉴别和测定18个不同样品中的桑辛素，且试验中使用全自动点样仪点样，能很好控制点样量，减小实验误差。与其他方法相比较，薄层扫描法可在同一薄层板上同时分离、分析多个样品；灵敏度高，适于分析小量样品；流动相用量少且选择范围宽、方便更换；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求低；软件自带数据处理，结果准确、快速。因此，本方法是一种简单、快速和廉价的方法，是HPLC法、UPLC法的重要补充。适合于桑辛素的常规分析，可作为桑白皮中桑辛素含量控制的新的参考方法。