趋化因子CX3CL1基因rs170364位点与脑梗死发病相关关系

苏东风， 李岩松， 潘浩圃

解放军第四六三医院 神经内科，辽宁 沈阳 110042

脑梗死在临床被称为缺血性脑卒中，其发病机制为脑部血液供应中断，导致局部脑组织的缺血、缺氧，引起局部脑组织发生缺血性坏死[1-2]。在临床上由于脑梗死的危害巨大，脑组织缺血坏死区域多引起患者定位功能障碍，给患者及其家庭带来经济上的负担及精神上的伤害。目前，有研究报道，脑血管内膜的增厚及相应的脑血管动脉粥样硬化性疾病是导致脑梗死发生的重要原因，脑血管粥样硬化反应是一种炎性因子引起的免疫炎性反应，由于炎性因子的激活，导致脑血管动脉粥样硬化反应的加剧[3-6]。CX3CL1是趋化性细胞因子超家族的重要成员，目前有研究发现，其在脑血管动脉粥样硬化的发病过程中发挥着重要作用[7-8]。CX3CL1与CX3CR1受体结合引起炎性细胞(如单核巨噬细胞、中性粒细胞)在脑血管壁聚集，并释放炎症因子，导致脑血管的狭窄，进而引发脑梗死[9]。随着人类基因组计划顺利实施，大规模的脑梗死易感基因的筛查成为研究的热点[4-6]。本研究旨在探讨CX3CL1基因rs170364位点与脑梗死发生的相关关系，进而为脑梗死早期预防提供新的分子生物学靶标。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2015年12月至2017年12月在解放军463医院进行入院诊治的脑梗死患者430例为观察组，收集同期在本院健康体检中心进行体检的健康人员410名为对照组。本研究入选的研究对象均为中国北方汉族人群。脑梗死诊断标准：患者须经颅脑CT或脑MRI检查有明确证据证实为脑梗死；发病时间≤72 h。排除标准：患有肾、肝、甲状腺、血液系统、免疫系统疾病以及肿瘤的患者，或存在炎症、感染、糖尿病及家族性高脂血症的患者。本研究经医院医学伦理委员会批准，入选的研究对象均知情并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 基因分型 在空腹状态下，收集两组研究对象的外周血5 ml，利用乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)进行抗凝，-20℃冰箱储存[10]。利用北京天根生物试剂公司生产的DNA提取试剂盒提取两组研究对象的基因组，测定DNA浓度。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增入观察组及对照组的基因组DNA，利用Primer 5.0软件设计CX3CL1 rs170364引物，上游引物：5′-TATGTTTGTGGTATGTTCTG-3′，下游引物：5′- TGAGGTACAGTGAGATGAAC-3′。将含有CX3CL1 rs170364目的片段在25 μl PCR扩增反应体系中进行反应，包括基因组DNA 0.2 μg，10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP 1.5 μl，上游和下游引物各1.0 μl，rTaq酶3 U，去离子水25.0 μl，PCR扩增反应在热循环仪(美国BIO-RAD公司)上完成。反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s、54℃ 45 s、55℃ 45 s，35个循环；72℃ 30 s；72℃最后延伸7 min。将扩增好的PCR产物经纯化后送到上海生工科技有限公司进行测序。

1.2.2 酶联免疫吸附测定方法检测血清中白细胞介素-8的含量 于入院当日或次日清晨状态下抽取研究对象肘静脉血5 ml，摇匀后放置，3 000 r/min，离心20 min，将处理好的血浆贮藏于-80℃低温冰箱保存。按照试剂盒说明书，以标准品浓度为横坐标，以光密度(optical density，OD)值为纵坐标，画出标准曲线，根据标准曲线，计算出两组研究对象的每个测定样品的实际OD值，并计算每个待测样品的浓度[10]。

2 结果

2.1 两组研究对象一般资料比较 观察组患者的年龄、吸烟比例、高血压发生率、低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、三酰甘油水平均明显高于对照组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；高密度脂蛋白胆固醇水平显低于对照组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两组研究对象体质量指数及性别比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2 两组研究对象基因分型及等位基因分布频率比较 CX3CL1基因rs170364单核苷酸多态的GG型、GT型、TT型3种基因型在观察组患者中的分布频率分别为40.5%(174/430)、48.4%(208/430)和11.2%(48/430)，在对照组中的分布频率分别为50.7%(208/410)、39.8%(163/410)和9.5%(39/410)，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。CX3CL1基因rs170364多态的G、T等位基因的分布频率在对照组分别为70.6%(579/820)、29.4%(241/820)，在观察组分别为64.7%(556/860)、35.3%(304/860)，组间比较，差异均有统计学意义(P=0.009；OR=0.76，95%可信区间0.020～0.934)。多元回归分析在校正年龄、吸烟、高血压、高脂血症等脑梗死的危险因素后，CX3CL1基因rs170364单核苷酸多态T等位基因仍是脑梗死发病的一个独立危险因素。

2.3 两组研究对象CX3CL1 rs170364不同基因型携带者血浆CX3CL1水平比较 观察组患者的血浆中CX3CL1的表达水平为(2 437.96±579.85)μg/L，明显高于对照组的(1 962.85±527.98)μg/L，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者GT+TT基因型携带者血浆中CX3CL1表达水平为(2 530.32±613.13)μg/L，高于对照组GT+TT等位基因携带者的(2 130.24 ±534.62)μg/L，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组GG等位基因携带者血浆中CX3CL1表达水平为(2 345.67±546.57)μg/L,高于对照组的(1 723.46±521.34)μg/L，但组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

近年来，脑梗死的发病率呈逐年增高的趋势，而且脑梗死的发病年龄愈来愈年轻化。因而早期诊断、早期预测、早期治疗脑梗死已成为临床工作中临床医师亟待解决的问题。近年来有研究报道，动脉粥样硬化是脑血管疾病发生的病理生理基础，动脉管壁的慢性炎症引起动脉粥样硬化反应加剧，导致脑血管阻塞性反应，引起脑梗死的发生，免疫介导的炎性反应是导致脑血管动脉粥样硬化反应加剧的基础[11-12]。

CX3CL1是趋化因子家族中的重要成员，具有膜结合和可溶性两种形式，存在于体液中。CX3CL1趋化因子一方面可以与CX3CR1受体结合，引起炎性反应，具有趋化因子诱导炎性反应的功能，另一方面CX3CL1具有细胞黏附分子的功能，参与炎症局部的级联放大反应，CX3CL1的双重作用使之成为重要的炎性趋化因子[13]。趋化因子CX3CL1通过招募血液中炎性反应细胞如单核细胞和T细胞到动脉粥样硬化血管壁，引起管腔局部的炎性级联放大效应，血管壁局部炎性反应加剧，引起粥样硬化斑块的进展并突出管腔，引起局部血流缓慢，管腔狭窄甚至脑梗死[14]。

随着人类基因组计划的顺利实施，人类的遗传学信息被更多认识和利用，由于功能基因靶序列的改变进而引起蛋白表达水平的改变，导致细胞生物学功能的改变。通常认为基因的启动子区、外显子区、5′非翻译区及3′非翻译区编码基因的改变影响蛋白表达水平的改变。近年来，越来越多的研究证实基因内含子区域多态的改变也同样影响基因功能的改变，进而导致蛋白表达水平的异常，影响了疾病的发生、发展进程[15]。

rs170364多态位于CX3CL1基因的内含子区，本研究发现，在中国汉族人群中CX3CL1 基因rs170364单核苷酸多态与脑梗死发生存在相关关系，观察组患者T基因型携带者血浆中CX3CL1表达水平高于对照组，差异有统计学意义。CX3CL1基因rs170364单核苷酸多态改变虽然位于基因的非编码区域，但其多态改变影响CX3CL1内含子的剪接功能，故影响CX3CL3蛋白的表达[16-17]，影响动脉血管壁的炎性反应过程。

本研究为单中心研究结果，且收集样本量相对较少，希望能扩大样本并进行多中心的研究来验证本研究的结果。同时，本研究入选的研究人群为中国北方汉族人群，需要在不同民族的人群中验证上述研究结果。

综上所述，CX3CL1在观察组患者的血清中表达水平明显高于对照组。CX3CL1 rs170364 T等位基因可能是脑梗死发病的危险因素，可以预测脑梗死的发生，为脑梗死的临床预防研究提供分子遗传学的靶标。