重复经颅直流电刺激对帕金森病模型大鼠抑郁行为的改善作用及其机制

王春雷，常永丽，韩玲娜

(1.长治医学院生物医学工程系，山西 长治 046000； 2.长治医学院生理学教研室，山西 长治 046000)

经颅直流电刺激(transcranial direct current stimulation,tDCS)是一种非侵入性的、无创的脑刺激技术，利用微弱的直流电调节大脑皮层神经元电活动，从而影响大脑皮层的功能[1]。研究[2]显示：tDCS可明显改善抑郁症患者的抑郁行为。单次tDCS的作用持续时间短，使用重复tDCS可以延长作用持续时间[3-4]，在临床应用更为广泛。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的临床表现以运动系统症状为主，同时伴有一系列精神障碍，抑郁是PD患者最常见的一种精神障碍[5]。已有研究[6-7]证明：重复tDCS对PD大鼠和患者的运动系统症状有明显的改善作用，但重复tDCS对PD相关抑郁行为是否具有改善作用以及其作用机制尚不清楚。本实验采用重复阳极或阴极tDCS刺激PD大鼠额叶区，通过观察PD大鼠抑郁行为的变化以及抑郁相关脑区单胺类递质水平的变化，探讨重复tDCS对PD相关抑郁行为的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 32只健康雄性SD大鼠，体质量230～280 g，由西安交通大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(陕)2012-003。6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、地昔帕明、阿扑吗啡(apomorphine,APO)购自美国Sigma公司。脑立体定位仪购自深圳瑞沃德公司，经颅直流电刺激仪由西安交通大学生物医学工程研究所提供。

1.2 实验分组 大鼠在标准环境下适应性饲养1周后进行实验。32只大鼠随机分为假手术组、PD组、阳极重复tDCS组和阴极重复tDCS组，每组8只。

1.3 PD模型的制备 除假手术组外，其余各组大鼠采用右侧内侧前脑束(medial forebrain bundle,MFB)局部注射6-OHDA制备单侧完全损毁的PD大鼠模型。大鼠经腹腔注射4%水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉后，固定于脑立体定位仪上。于术前30 min腹腔注射地昔帕明(25 mg·kg-1)以保护去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)能神经元。头部正中切开，暴露颅骨，根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧MFB坐标(AP：- 4.4 mm；L：1.2 mm；D：7.8～7.9 mm)，于MFB坐标上方颅骨处钻直径 2 mm小孔，剥离硬脑膜，暴露脑表面。将尖端粘有玻璃微电极的10 μL微量进样器推进至MFB位置，并以缓慢速度将4 μL含12 μg 6-OHDA的溶液注射至右侧MFB。假手术组大鼠MFB位置局部注射等量的生理盐水。

APO诱导旋转行为实验用于模型检测，于造模术后1周进行。大鼠颈部皮下注射APO(0.05 mg·kg-1)，观察15 min内大鼠的行为，如果出现恒定向健侧(左侧)旋转，且大于25圈/ 5 min，则视为模型制备成功，其余均予以淘汰。本实验所用PD大鼠注射APO后，5 min内旋转均大于32圈。

1.4 tDCS 于造模术后2周进行刺激电极固定。刺激电极采用直径为2 mm的圆柱形塑料管，管内填充导线和海绵，用牙科水泥将刺激电极固定于大鼠右侧额叶区，参考电极固定于胸腹部。刺激时用生理盐水将海绵浸湿保证电极的导电性[8]。为了保证不烧伤大鼠脑组织，采用80 μA直流电流作为刺激电流[9]。电极固定24 h后进行直流电刺激实验。其中假手术组和PD组大鼠不给予电刺激。阳极重复tDCS组大鼠给予电流强度为80 μA阳极电流刺激，阴极重复tDCS组大鼠则给予相同强度的阴极电流刺激。各重复tDCS组大鼠给予重复tDCS，强度不变，每天刺激时间为30 min，连续刺激10 d。

1.5 行为学实验 tDCS结束后进行强迫游泳实验和蔗糖偏好实验检测大鼠的抑郁行为。①强迫游泳实验：第1天进行适应性训练，将大鼠放入水中游泳15 min，24 h后进行检测，记录将大鼠放入水中 5 min内的不动时间。不动时间定义为大鼠静止漂浮于水面而不做任何动作，或为了保持头部露出水面而仅作的微小活动保持的时间。不动时间可作为抑郁行为的检测指标[10]。②蔗糖偏好实验：将大鼠单笼饲养，双瓶饮1%蔗糖溶液24 h，适应后禁食禁水24 h，再同时给予水和1%蔗糖溶液各1瓶，自由饮水1 h，期间随意交替2瓶位置数次。1 h 内蔗糖消耗量可反映大鼠的抑郁行为表现，减少的蔗糖消耗量可作为抑郁行为的检测指标[11]。蔗糖消耗量=[糖水消耗量/(糖水消耗量+水消耗量)]×100%。

1.6 神经化学检测 行为学实验后，采用高效液相色谱-电化学法检测各组大鼠脑内抑郁相关脑区内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)和中缝核(raphe nuclei,RN)中单胺类递质多巴胺(dopamine,DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和NA水平。具体方法：大鼠断头取脑，迅速分离出mPFC和RN，称质量，按照每4 mg组织加入1 mL高氯酸(0.3 mol·L-1)的比例加入高氯酸，采用超声粉碎仪将组织匀浆，4 ℃低温离心后去上清液，按1∶2比例将上清液与流动相混合，吸取20 μL混匀的样本加入自动进样器中，单胺类递质通过分析柱被分离后，经电化学检测器定量分析，计算组织中各种单胺类递质水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠抑郁行为 与假手术组比较，PD组大鼠的不动时间明显延长(t=4.437,P<0.01)，蔗糖消耗量明显减少(t=3.354,P<0.05)，提示PD模型大鼠有抑郁行为表现。与PD组大鼠比较，重复tDCS组大鼠的不动时间明显降低，其中阳极重复tDCS组(t= 4.572,P<0.01)较阴极重复tDCS组(t=3.585,P<0.05)降低更明显；与PD组比较，阳极重复tDCS组大鼠的蔗糖消耗量明显增加(t=3.095,P<0.05)，而阴极重复tDCS组大鼠的蔗糖消耗量虽然有增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不动时间和蔗糖消耗量

GroupImmobility time(t/s) Sucrose consumption(η/%)Sham operation41.38±3.52 76.18±6.29PD 78.63±9.33∗∗55.10±3.96∗Anodal repeated tDCS42.75±4.04△△ 74.55±4.01△Cathodal repeated tDCS51.75±5.35△ 64.23±2.76

*P<0.05，**P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with PD group.

2.2 各组大鼠mPFC和RN中单胺类递质水平 在mPFC中，与假手术组比较，PD组大鼠DA和5-HT水平明显降低(DA：t=3.203,P<0.05；5-HT：t=4.492,P<0.01)，但NA水平无明显变化(P>0.05)；与PD组比较，阳极重复tDCS组大鼠DA和5-HT水平均明显升高(DA：t= 2.961,P<0.05; 5-HT：t=3.142,P<0.01)，阴极重复tDCS组大鼠仅5-HT水平明显升高(t=2.843,P<0.05)，阳极重复tDCS组和阴极重复tDCS组大鼠mPFC中NA水平均无明显变化(P>0.05)。在RN中，与假手术组比较，PD组大鼠5-HT水平明显降低(t=3.318,P<0.01)，DA和NA水平虽有下降趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)；与PD组比较，阳极重复tDCS组大鼠DA和5-HT水平均明显升高(DA:t=3.881,P<0.01; 5-HT:t=3.870,P<0.01)，NA水平无明显变化(P>0.05)；阴极重复tDCS组大鼠DA和NA水平无明显变化(P>0.05)，mPFC中5-HT水平明显升高(P<0.05)。见表2。

3 讨 论

PD是一种神经系统退行性疾病，临床上以运动系统症状为主，同时伴发有一系列非运动系统症状[12]。抑郁是PD最常见的非运动系统症状，其在PD患者中发生率达到40%～ 50%，严重影响患者的生活质量[13]。本研究中，与假手术组比较，采用单侧MFB注射6-OHDA制备的PD模型大鼠出现不动时间的明显延长和蔗糖消耗量的明显降低，提示黑质致密部单侧完全损毁可以诱发大鼠出现抑郁行为，与以往的研究[14]结果一致。目前，对PD抑郁的治疗方法主要包括心理疗法、药物治疗和行为学治疗等，治疗效果不佳，甚至会出现严重的副作用。

表2 各组大鼠mPFC和RN中DA、5-HT和NA水平

Tab.2 Levels of DA,5-HT and NA in mPFC and RN of rats in various groups

GroupDAmPFCRN5-HTmPFCRNNAmPFCRNSham operation300.02±52.59286.22±35.41679.17±177.911488.22±101.44675.46±53.35416.26±49.39PD 142.98±20.51∗224.38±28.92372.86±38.58∗∗883.66±145.29∗∗517.79±46.32334.21±25.09Anodal repeated tDCS288.16±32.12△424.08±45.74△△587.13±48.46△△1588.88±148.53△△590.14±29.31454.31±67.08Cathodal repeated tDCS200.38±24.28295.01±33.35566.69±109.74△1330.44±113.39547.06±30.68361.31±20.12

*P<0.05，**P<0.01 compared with sham operation group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with PD group.

tDCS是一种非侵入性的脑刺激技术，已有研究[2，15-16]表明tDCS对抑郁行为有明显的改善作用，加之tDCS不良反应少、使用方便，在临床上已经成为治疗抑郁的一种新方法。tDCS对于PD相关抑郁行为是否有治疗作用，目前尚无相关报道。本研究拟通过对PD模型大鼠使用重复tDCS，观察大鼠的抑郁行为及相关脑区单胺类递质水平的变化，揭示tDCS对PD相关抑郁行为的作用及其相关机制，为临床寻找新方法治疗PD相关抑郁行为提供理论依据。

tDCS分为阳极tDCS和阴极tDCS，电极的阳极靠近神经元胞体或树突时，膜电位降低，发生去极化，神经元兴奋性增强；相反，阴极靠近时膜电位升高，发生超极化，神经元兴奋性降低[17]。本研究结果显示：阳极重复tDCS和阴极重复tDCS对PD相关抑郁行为均有一定作用。在强迫游泳实验中，阳极重复tDCS组和阴极重复tDCS组PD大鼠的不动时间均明显缩短；在蔗糖偏好实验中，阳极重复tDCS组PD大鼠的蔗糖消耗量明显增加，阴极重复tDCS组大鼠虽然有增加趋势，但差异无统计学意义。在反映抑郁行为的2种实验中大鼠出现以上差异，可能是因为重复tDCS对PD大鼠的运动行为会有一定的改善作用[5]，而大鼠在强迫游泳实验中的不动时间长短一定程度上也与其运动能力有关，而蔗糖偏好实验恰好能够排除tDCS对大鼠运动能力的影响 。本研究提示：重复tDCS对PD相关抑郁行为具有改善作用，其中阳极重复tDCS的作用强于阴极重复tDCS。

研究[18]表明：tDCS具有抗抑郁作用，其机制可能是tDCS通过提高神经元可塑性以缓解抑郁症状。目前临床使用的抗抑郁药可提高中枢神经系统中单胺类递质水平[19-20]，说明单胺系统在抑郁行为中发挥重要作用。tDCS的抗抑郁作用与脑内单胺类递质水平变化是否有关，目前尚无相关报道。本研究采用高效液相-电化学法观察假手术组、PD组、阳极重复tDCS组和阴极重复tDCS组大鼠脑内mPFC和RN中DA、5-HT及NA水平的变化，结果显示：与假手术组比较，PD组大鼠mPFC中DA及5-HT水平明显降低，RN中5-HT水平明显降低，提示PD大鼠出现抑郁行为与脑内DA及5-HT水平降低有关；与PD组比较，阳极重复tDCS组大鼠mPFC和RN中DA和5-HT水平明显升高，阴极重复tDCS组只有mPFC中5-HT水平明显升高，RN中5-HT以及mPFC和RN中DA水平有升高趋势，但差异无统计学意义，而阳极和阴极重复tDCS对NA水平均无明显影响。因此，重复tDCS可以升高大鼠脑内单胺类递质水平，尤其是DA和5-HT水平，这可能是tDCS发挥抗抑郁效应的机制之一。

本研究结果证实：通过对额叶区使用重复tDCS可改善大鼠PD相关抑郁行为，该作用可能与改变相关脑区中单胺类递质水平有关。阳极重复tDCS对大鼠抑郁行为的改善作用强于阴极重复tDCS，其具体机制尚不明确，需要后续进一步研究。