UHPLC-LTQ-Orbitrap HRMS法结合特征裂解途径分析鉴定薄荷水提物中4种类群化学成分

徐露露，焦其树，杨佳颖，王 菲，王子健，姜艳艳，刘 斌，张加余

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.北京中医药大学北京中医药研究所，北京 100029)

薄荷(Menthae Haplocalycis herba)为唇形科植物薄荷MenthaeHaplocalyxBriq.的干燥地上部分，是一种药食两用的中药，具有疏散风热、清利头目等功效，临床上主要用于风热感冒、风温初起等[1]。目前，对于薄荷的研究多集中于挥发性成分在药理及毒性方面的分析[2-4]。有研究表明，薄荷中的非挥发性成分同样具有一定的药理活性，如一些酚酸类、黄酮类、萜类化合物具有一定的抗炎、抗病毒、抗氧化等活性[5-7]，但尚未见对薄荷水提物中化学成分的系统性鉴定研究。

超高效液相色谱-质谱法(UHPLC-MS)结合了超高效液相色谱的快速分离能力和质谱的高灵敏度、高专属性的检测能力，现已成为中药(复方)复杂体系成分结构鉴定的常用方法[8-9]。线性离子阱-串联静电轨道阱(LTQ-Orbitrap)高分辨质谱仪可提供分辨率高达100 000的相对分子质量和丰富的碎片信息，在药物化学的分析研究、药效物质基础研究等方面具有独特的优势[10]。但是，由于中药是一个非常复杂的物质系统，单纯依靠检测技术的进步难以实现其化学成分的全面鉴定。中药化学成分一般都是经一种或者几种生源途径生物合成的，意味着同一味中药中的大部分成分呈现类群特征，即拥有相同或者相似的母核骨架或者亚结构。在电喷雾质谱裂解过程中，一般会发生类似的特征性质谱裂解反应，可以揭示该类母核骨架或者亚结构，对于从中药复杂物质体系中筛选鉴定相应的目标化学成分具有重要意义。

本工作拟采用UHPLC-LTQ-Orbitrap HRMS结合特征裂解途径对薄荷水提物中的4种类群化学成分进行较为全面的分析和鉴定，希望为薄荷的药材质量控制，药效物质基础研究和临床应用提供参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪，LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-串联静电轨道场质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)，Xcalibur 2.1工作站；Sartorious BT 25S 型十万分之一电子分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司产品；KQ-100DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品。

1.2 药材与试剂

薄荷药材：安国市祁奥饮片有限公司产品，经北京中医药大学中药鉴定系张媛副教授鉴定为薄荷MenthaeHaplocalyxBriq.的干燥地上部分，其标本存于北京中医药大学中药学院；乙腈、甲醇和甲酸：均为色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；分析用水：杭州娃哈哈有限公司产品；木犀草苷、蒙花苷、香叶木苷、柚皮苷等对照品：纯度>98%，成都曼斯特生物科技有限公司产品；橙皮苷和迷迭香酸等对照品：纯度>98%，由中国食品药品检定研究院提供；薄荷苷A对照品：自制，经UV、NMR及MS方法进行了结构确定[11]，由HPLC峰面积归一化法测得其纯度大于98%。

1.3 溶液的配制

1.3.1标准品溶液的制备 分别精密称取适量的薄荷苷A、木犀草苷、柚皮苷、香叶木苷、橙皮苷、蒙花苷和迷迭香酸对照品，加入甲醇超声溶解，配制成一定浓度的混合溶液A(薄荷苷A、木犀草苷、柚皮苷、香叶木苷)和B(橙皮苷、蒙花苷和迷迭香酸)，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得标准品溶液。

1.3.2供试品溶液的制备 称取10 g切成5～8 mm大小的薄荷药材，加入100 mL水浸泡1 h，煎煮2次，每次1 h，合并得到的水提液，浓缩至约100 mL，静置冷却后，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流动相：A 为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～2 min(5%B)，2～7 min(5%～8%B)，7～20 min(8%～19.5%B)，20～23 min(19.5%～55%B)，23～25 min(55%～75%B)，25～30 min(75%～100%B)，30～32 min(100%～5%B)；流速0.30 mL/min；柱温35℃；进样量2 μL。

1.4.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测；鞘气和辅助气：均为氮气，纯度>99%；碰撞气：氦气，纯度>99.99%；鞘气流速40 arb，辅助气流速20 arb；电离源电压4 kV；离子源温度350 ℃；毛细管电压25 V；管透镜电压110 V。样品采用FT全扫描，质量扫描范围m/z100～1 000，检测分辨率为30 000；二级质谱采用数据依赖型扫描(data dependent scan, DDS)，选取一级质谱丰度最高的3个离子进行碰撞诱导解离(collision induced dissociation, CID)碎片扫描，CID 激活单位0.25 q，激活时间30 ms，归一化碰撞能量为35%。

2 结果与讨论

2.1 薄荷药材中类群成分代表性对照品特征裂解规律分析

将混合对照品进行LC/MS分析，采集数据并得到二级碎片离子后，总结黄酮类、酚酸类及萜类的裂解规律，并进行快速筛选鉴定。由于缺乏苯丙素类化合物的对照品，故结合特征碎片及离子丰度等信息，对苯丙素类化合物进行鉴定。

2.1.1黄酮类化合物裂解规律分析 柚皮苷标准品的质谱图和裂解途径示于图1，其准分子离子峰为[M+H]+m/z581.186 5(C27H33O14，误差<5×10-6)。经碰撞诱导解离后，产生了一系列二级碎片离子m/z563、545、527、461、459、435、419、417、401、315和273。其中，m/z563、545和527由母离子的糖基部分相继脱去1分子H2O产生；特征离子m/z435为[M+H]+脱去质量数为146 u的中性碎片产生，推测该中性碎片为鼠李糖；m/z273为m/z435[M+H-Rha]+继续失去质量数为162 u的中性碎片后生成的离子，推测该中性碎片为葡萄糖；m/z419为m/z435 [M+H-Rha]+脱去氧原子产生的特征离子；m/z461为母离子发生RDA裂解失去120 u的中性碎片产生，此反应为黄酮类成分的特征性反应；m/z417为m/z461[M+H-120]+失去羰基和氧原子产生的碎片离子。

综上所述，黄酮类化合物在质谱中容易失去 C环中的羰基(-28 u)和氧原子O(-16 u)，且易发生RDA 裂解。薄荷中黄酮苷多为芸香苷、葡萄糖苷和鼠李糖苷。在相同的碰撞能量下，黄酮苷易连续脱去葡萄糖和鼠李糖(-162 u-146 u)、葡萄糖(-162 u)、鼠李糖(-146 u)等中性碎片，且易发生 RDA 裂解。

图1 正离子模式下，柚皮苷标准品的质谱图(a)和裂解途径(b)Fig.1 MS spectra (a) and fragmentation pathway (b) of naringin at positive ion mode

2.1.2酚酸类化合物裂解规律分析 迷迭香酸标准品的质谱图和裂解途径示于图2，其准分子离子峰为[M+H]+m/z361.091 8

(C18H17O8，误差<5×10-6)，其特征二级碎片离子有m/z343 [M+H-H2O]+，m/z315 [M+H-H2O-CO]+，m/z181 [M+H-C9H8O4]+，m/z163 [M+H-C9H10O5]+和m/z145 [M+H-H2O-C9H10O5]+。前期研究发现，薄荷中酚酸类成分的基本骨架多由咖啡酸和丹参素组成，因此，酚酸类化合物易发生中性丢失脱去咖啡酸(-180 u)和丹参素(-198 u)，且易脱去一些小分子化合物，如H2O(-18 u)和CO(-28 u)等。

图2 正离子模式下，迷迭香酸标准品的质谱图(a)和裂解途径(b)Fig.2 MS spectra (a) and fragmentation pathway (b) of rosmarinic acid at positive ion mode

2.1.3萜类化合物裂解规律分析 薄荷苷标准品的质谱图和裂解途径示于图3，其准分子离子峰 [M+Na]+为m/z373.183 3(C18H16O8Na，误差<5×10-6)，属于单萜苷类成分，主要的二级碎片离子有m/z355 [M+Na-H2O]+、m/z211 [M+Na-Glc]+、m/z193 [M+Na-OGlc]+和[M+Na-H2O-Glc]+。通过以上分析发现，萜类化合物容易脱去母核上的一些小分子取代基，比如羟基等，除此之外，脱去糖也是其主要特征。

2.2 薄荷水提物化学成分鉴定

按照1.4节方法分析薄荷水提物及其标准品，得到正离子模式下的总离子流图，分别示于图4、图5。根据获得的精确分子质量信息推测其可能的元素组成，并结合多级质谱裂解碎片种类和丰度等信息，通过标准品比对及查阅相关文献，对薄荷水提物中的化学成分进行鉴定，结果列于附表1(因篇幅所限，请读者登录本刊网站于该文章下载处下载附表1)。

图3 正离子模式下，薄荷苷标准品的质谱图(a)和裂解途径(b)Fig.3 MS spectra (a) and fragmentation pathway (b) of bohenoside A at positive ion mode

图4 薄荷水提物的总离子流图Fig.4 TIC of aqueous extracts from Menthae Haplocalycis herba at positive ion mode

注：1.薄荷苷A；2.木犀草苷；3.柚皮苷；4.香叶木苷；5.橙皮苷；6.蒙花苷；7.迷迭香酸图5 标准品的总离子流图Fig.5 TIC of standards from Menthae Haplocalycis herba at positive ion mode

2.2.1黄酮类群化合物的结构鉴定 薄荷中的黄酮类化合物主要有二氢黄酮和二氢黄酮苷、黄酮和黄酮苷。根据黄酮类成分的裂解规律及相关文献[12-21]，从薄荷水提物中共鉴定出38种黄酮类成分，包括2种二氢黄酮、4种二氢黄酮苷、20种黄酮、10种黄酮苷、2种异黄酮，其中橙皮苷、香叶木苷、柚皮苷、木犀草苷和蒙花苷通过标准品比对鉴定，其余化合物的鉴定主要以F22(二氢黄酮)、F26(黄酮苷)和一对同分异构体(黄酮)F36和F38为例进行详述。

化合物F22的保留时间为18.23 min，在正离子模式下，其准分子离子峰为[M+H]+m/z303.085 4，根据元素组成分析，该化合物的分子式为C16H14O6。主要碎片离子为m/z285、179、177、153、147、137。其中，m/z285为母离子失去1分子H2O得到的；m/z177可能为母离子丢失B环产生，这是二氢黄酮的典型裂解方式；m/z153、147、137为黄酮骨架发生RDA裂解而产生。由此可知，该黄酮母核A环上有2个—OH，B环上有1个—OH和1个—OCH3。通过与文献[12]对比，发现该化合物的串联质谱碎裂规律与橙皮素相符， 因此推断化合物F22为橙皮素。

化合物F26的保留时间为20.23 min，其准分子离子峰为[M+H]+m/z595.200 9，根据元素组成分析，该化合物的分子式为C28H34O14。主要的二级碎片离子有m/z577、559、449、448、433、287。其中，m/z449为[M+H]+失去质量数为146 u的中性碎片后生成的离子，推测该中性碎片为鼠李糖；m/z433为[M+H]+脱去质量数为162 u的中性碎片后产生的特征离子，推断该中性碎片可能为葡萄糖；m/z287为[M+H]+相继失去葡萄糖和鼠李糖中性碎片后生成的离子。说明该化合物并非直接脱去糖基，而是逐步失水产生m/z577、m/z559碎片离子。根据文献报道[13-14]，留兰香中含有香蜂草苷，且香峰草苷的裂解途径与化合物F26相符，通过与标准品比较，进一步确定该化合物为香蜂草苷。

化合物F36和F38的保留时间分别为25.09 min 和27.29 min，在正离子模式下，二者具有相同的准分子离子峰[M+H]+m/z359.112 5，根据元素组成分析，其分子式均为C19H18O7。二者的主要碎片离子为m/z344 [M+H-CH3]+、m/z326 [M+H-CH3-H2O]+、m/z298 [M+H-CO2-OH]+；此外，F36还产生了m/z343 [M+H-O]+和m/z315 [M+H-O-CO]+碎片离子，而F38还产生了m/z329 [M+H-2CH3]+和m/z311 [M+H-OCH3-OH]+碎片离子。因此推测化合物F36和F38分别为5-羟基-6，7，3’，4’-四甲氧基黄酮和栀子黄素B。根据文献报道[13]，辣薄荷中含有5-羟基-6,7,3’,4’-四甲氧基黄酮和栀子黄素B，通过比较二者的ClogP值发现，前者极性大于后者，这与本实验的鉴定结果相符。

2.2.2酚酸类群化合物的结构鉴定 通过对薄荷中代表性的酚酸类成分进行分析得出其裂解规律，并结合相关文献[22-24]，从薄荷水提物中共鉴定出16种酚酸类成分，其中迷迭香酸通过标准品鉴定，其他化合物的鉴定以PA1、PA11、PA13和PA15为例进行阐述。

2.2.3萜类群化合物的结构鉴定 薄荷水提物中的萜类以单萜及单萜苷为主，还有少量的其他萜类成分。本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap技术对薄荷水提物进行分析，通过分析裂解规律，并查阅文献[25-27]，从薄荷水提物中共鉴定出24种萜类成分，包括10种单萜、13种单萜苷和1种三萜，其中薄荷苷A是通过与标准品比对确定的。以化合物T2和T5为例，介绍薄荷水提物中萜类成分的鉴定过程。

化合物T2和T5的保留时间分别为5.09、6.21 min，准分子离子峰均为[M+H]+m/z185.117 2，根据元素组成分析，分子式均为 C10H16O3。通过碰撞诱导解离，二者的主要碎片离子有m/z167 [M+H-H2O]+和m/z149 [M+H-2H2O]+，说明二者均含有2个—OH。此外，化合物T2还产生了m/z157 [M+H-CO]+、m/z143 [M+H-C3H7]+碎片离子；而化合物T5还产生了m/z139 [M+H-H2O-CO]+和m/z125 [M+H-H2O-C3H7]+碎片离子。通过对比二者的ClogP值，推测化合物T2和T5可能分别为(2R,3R)-2,3-Dihydroxy-3-methyl-6-(propan-2-ylidene)cyclohexanone和 (1R*,2S*)-1,2-Dihydroxy-ρ-menth-4(8)-en-3-one[26]。

2.2.4苯丙素类群化合物的结构鉴定 由于薄荷中苯丙素类成分的含量较低，标准品不易获得，因此，通过分析其特征碎片，最终从薄荷水提物中鉴定出7种苯丙素类化合物，鉴定过程以化合物P2和P3为例进行详述。

化合物P2和P3的保留时间分别为 11.90 min和12.12 min，准分子离子峰为[M+Na]+m/z531.183 7，根据元素组成分析，其分子式均为C25H32O11。二者的主要碎片离子均为m/z513 [M+Na-H2O]+、m/z501 [M+Na-CH2O]+、m/z369 [M+Na-Glc]+、m/z351 [M+Na-Glc-H2O]+，说明二者结构相似，均有葡萄糖和—CH2OH结构。化合物P2支链断裂产生了m/z471 [M+Na-C3H8O]+碎片离子，通过比较二者的ClogP值，发现化合物P3的极性小于P2，推测化合物P2和P3分别为Clemastanin A和(2R,3R)-2-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-5-(3-hydr-oxypropyl)-2, 3-dihydro-1-benzofuran-7-yl-β-D-glucopyranoside。

3 结论

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap HRMS技术对薄荷水提物中的化学成分进行系统研究，通过高分辨质谱中的精确分子质量信息得到元素组成以及裂解碎片数据，结合标准品比对、裂解规律及相关文献初步分析鉴定出85种化合物，包括38种黄酮、16种酚酸、7种苯丙素和24种萜类，该实验结果可为薄荷的药材质量控制、药效物质基础研究和临床应用奠定基础。