气相色谱-正化学电离源-飞行时间质谱法测定烟草吸食者唾液中的吡嗪和吡啶类物质

司晓喜，张凤梅，朱瑞芝，刘春波，申钦鹏，尤俊衡，张 涛，缪明明，刘志华

(云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南省烟草化学重点实验室，云南 昆明 650231)

目前，烟草制品的风味评价是以人体感官评吸为主，很难排除主观产生的不确定性。卷烟抽吸过程中，主流烟气中的多种微量化学成分被口腔唾液选择性地溶解、吸收，这些被吸收的成分决定了烟草制品的风味[1-3]。研究唾液中溶解、吸收的烟气成分，能直接、客观地评价烟草制品的风味。

吡嗪和吡啶类化合物是卷烟烟气中一类重要的风味物质，具有炒坚果、可可、烤土豆、青椒和肉香等怡人的香味[4-5]。该类化合物沸点较低，易气化，目前主要采用GC/MS法检测，且较多使用电子轰击(EI)电离技术[5-6]。EI技术适用范围广，但在分析复杂基质成分时，特别是分子质量较小的分析物[7]，极易产生干扰。化学电离(CI)是一种软电离技术，碎片离子少、选择性好，其负化学源(NCI)对含电负性基团的物质具有高选择性和高灵敏度，但容易受分析物电负性强弱的影响，具有一定局限性[8]；其正化学源(PCI)在选用甲烷作为反应气时，适用范围更广泛，不受分析物电负性强弱的影响，对不同分析物的灵敏度差异较小[9-10]。将PCI与高分辨飞行时间质谱(TOF MS)联用可提高痕量分析物鉴定的准确性[11-12]。目前，国内外学者已将GC-PCI-MS技术成功应用于可卡因及其代谢物[13]、N-亚硝胺[14]、唑类杀菌剂[15]等物质的分析检测，但GC-PCI-TOF MS技术除了用于测定烟气中含硫化合物，其他报道较少[16]。

本工作拟建立气相色谱-正化学电离源-飞行时间质谱联用技术(GC-PCI-TOF MS)，并结合溶剂萃取、分散固相萃取，分析烟草吸食者唾液中的吡嗪和吡啶类物质，希望为开发卷烟产品提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-飞行时间质谱联用仪GCT Premier：配备正化学电离源，美国Waters公司产品； 3K30高速冷冻离心机：德国Sigma公司产品；VX-200漩涡混合仪：美国Labnet公司产品；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司产品；唾液收集管：德国Salivette公司产品；QuEChERS 2 mL分散固相萃取试剂盒：内含150 mg无水硫酸镁、50 mgN-丙基乙二胺键合固相吸附剂，美国Agilent公司产品；0.22 μm有机滤膜：天津市津腾实验设备有限公司产品。

二氯甲烷、乙腈：均为色谱纯，德国Merck公司产品；氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；人工唾液：广东省东莞市科鸿化工有限公司产品；吡啶、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、3-乙基吡啶、三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、四甲基吡嗪标准品：纯度≥99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司产品；市售卷烟样品。

1.2 实验方法

1.2.1唾液样品的采集 受试者用清水漱口2次后，按5口/支的抽吸速度抽吸1支卷烟。抽吸完成后，将棉棒放入口中，以每秒1次的频率咀嚼2 min后放入收集管，以5 000 r/min离心15 min后，得到唾液样品。间隔1 h，按上述步骤重复抽吸卷烟，并采集唾液样品。同一受试者共采集3次，合并3次收集的唾液作为供试样品，于4 ℃冷藏保存。

1.2.2样品前处理 准确移取5.0 mL唾液样品于具盖离心管中，加入2.5 mL二氯甲烷，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min振荡2 min，然后以5 000 r/min离心5 min，吸取下层液于样品瓶中。向剩余上层液中再加入2.5 mL二氯甲烷，按上述方法重复萃取1次，离心后取下层液合并于同一样品瓶中。将收集到的样品液于30 ℃下减压蒸发至近干，加入0.5 mL乙腈复溶。复溶液转移至2 mL QuEChERS分散固相萃取试剂盒，于漩涡混合振荡仪上以2 000 r/min振荡2 min，以5 000 r/min离心5 min，收集上层清液，待测。

1.2.3色谱条件 色谱柱：DB-35 MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃；载气(He)流速1 mL/min；进样量1 μL；不分流进样1 min；程序升温：35 ℃保持2 min，以7.5 ℃/min升至125 ℃，再以25 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.2.4质谱条件 PCI离子源；电子能量60 eV；离子源温度180 ℃；发射电流400 μA；传输线温度280 ℃；溶剂延迟4.5 min；CI源反应气为甲烷(纯度≥99.999%)，流量56%；质量扫描范围m/z50～400。以全氟三丁基胺为内标进行调谐，以m/z413.977 5处作单点锁定校正分析物碎片的精确质量数。9种分析物的保留时间及特征离子列于表1。

1.3 溶液的配制

1.3.1标准储备液 分别准确称取10.0 mg各标准品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制得9种目标分析物的标准储备液。

1.3.2混合标准使用液 准确移取2.0 mL吡啶标准储备液，0.4 mL 2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪标准储备液，0.1 mL 3-乙基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、2,3,5,6-四甲基吡嗪标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，制得9种目标分析物的混合标准使用液。

表1 9种目标分析物的保留时间和特征离子Table 1 Retention times and characteristic ions of nine analytes

1.3.3混合标准溶液 分别准确移取0.05、0.25、0.5、1.0和2.5 mL混合标准使用液于5支10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，配制系列混合标准溶液。其中，吡啶的质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/L；2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的质量浓度分别为0.02、0.1、0.2、0.4和1.0 mg/L；3-乙基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、2,3,5,6-四甲基吡嗪的质量浓度分别为0.005、0.025、0.05、0.1和0.25 mg/L。

2 结果与讨论

2.1 分析方法的建立

2.1.1前处理方法的优化 使用溶剂萃取法从唾液中萃取分离吡嗪和吡啶类物质。由于这两类物质都能溶于大多数极性及一些非极性溶剂，故选取较常用的二氯甲烷、乙腈作为萃取溶剂进行考察。由于唾液基质主要为水，二氯甲烷萃取后分层，乙腈则与唾液相溶。乙腈萃取参照经典QuEChERS法进行，通过加入除水剂和盐进行盐析萃取。

配制9种目标物浓度均为2.0 mg/L的人工唾液作为样品，以萃取率作为评价指标，考察以下3种萃取剂的萃取效果：1) 2.5 mL二氯甲烷；2) 0.5 g 氯化钠、2.5 mL二氯甲烷；3) 0.5 g氯化钠、2.5 g无水硫酸镁、2.5 mL乙腈。同时考察了萃取次数对萃取效率的影响，结果示于图1。

由图1a可以看出，当萃取次数为1时，以二氯甲烷为萃取剂，9种目标物的平均萃取率达83.6%，加入盐后目标物萃取率降低；以乙腈为萃取剂，对吡嗪类物质的萃取效率优于二氯甲烷，平均萃取率达92.9%，但对吡啶类物质的萃取率较低，平均萃取率仅为66.4%。由图1b可以看出，当萃取次数为2时，3种萃取剂对9种目标物的平均萃取率均超过95%，以二氯甲烷萃取效果最佳，平均萃取率达到97.7%，而乙腈对吡啶类物质的萃取率仅为71.2%。因此，选取二氯甲烷为萃取剂，萃取次数为2次。

2.1.2分析方法的建立 由于吡啶和吡嗪类物质的质量数均偏低(<200)，在使用EI源电离时，碎片离子响应偏低，背景干扰严重。而CI源为软电离源，其获得的碎片离子少、背景干扰少、响应灵敏度高，而且吡啶和吡嗪类化合物具有弱碱性和亲核性，适用于PCI源。

吡啶和吡嗪类物质在唾液中含量较低，且前处理后仍有少量干扰物，因此采用较低的初始温度和较缓慢的升温程序来实现干扰物与目标物分离。选择不分流进样，以增加目标物的响应值。选取响应值较高的分子离子(准分子离子)或碎片离子作为特征离子，9种分析物的特征离子列于表1。优化后的电离能为60 eV，在优化的条件下，9种分析物均实现良好分离，选择的特征离子响应值高，选择性好，不受唾液中其他组分的影响，抗基质干扰能力强，分析结果示于图2。

注：序号所代表化合物同表1；Method 1. 2.5 mL二氯甲烷；Method 2. 0.5 g 氯化钠、2.5 mL二氯甲烷；Method 3. 0.5 g 氯化钠、2.5 g无水硫酸镁、2.5 mL乙腈图1 不同方法萃取1次(a)与2次(b)时，唾液样品中吡嗪和吡啶类物质的萃取效果Fig.1 Comparison of extraction effect of pyrazines and pyridines in saliva samples by different methods for one time (a) and two times (b)

注：序号所代表化合物同表1图2 标准溶液的总离子流图(a)和烟草吸食者唾液样品的总离子流图、提取离子流图(b)Fig.2 Total ion chromatogram of standard solution (a) and total ion chromatogram and extraction chromatogram of tobacco smokers’ saliva (b)

2.1.3基质效应 唾液样品基质复杂，基质增强、减弱效应均会影响分析结果的准确性。在样品前处理过程中，采取有机溶剂萃取、分散固相萃取对唾液样品进行净化以去除基质，从而减少基质效应的影响。

同时，通过比较空白基质、乙腈配制的标准溶液的响应信号强度来评价基质效应。选取人工唾液作为空白基质，按照1.2.2节方法进行前处理，净化液蒸干后，加入0.5 mL标准溶液复溶，即得空白基质配制的标准溶液。选取0.05、1.0 mg/L 2个浓度混合标准溶液进行考察，乙腈、空白基质配制的标准溶液待测物响应值分别记为R1、R2，基质效应(ME)=R2/R1，结果列于表2。可以看出，9种分析物表现出不同程度的基质增强或减弱效应，但均在95.8%～108.9%之间，基质效应并不明显，可以忽略。

2.2 PCI-TOF MS的定性鉴定

PCI电离作用下，分子离子峰和相应的加合离子峰强度高，碎片离子少。当选用甲烷作为反应气时，吡嗪和吡啶类物质同甲烷离子主要发生酸碱质子转移反应，生成准分子离子[M+H]+。另外，样品离子还会同反应气离子发生加合反应，生成加合离子[M+C2H5]+([M+29]+)和[M+C3H5]+([M+41]+)。2-甲基吡嗪和5-乙基-2-甲基吡啶的PCI-TOF MS质谱图示于图3，由图可见，二者响应最强的碎片离子均为准分子离子[M+H]+，此外，二者均有较强的加合离子[M+29]+和[M+41]+。其他7种目标物也有类似现象，这有利于定性分析。

表2 基质效应考察Table 2 Influence of matrix effects

图3 2-甲基吡嗪(a)和5-乙基-2-甲基吡啶(b)的正化学电离-飞行时间质谱图Fig.3 PCI-TOF MS spectra of 2-methylpyrazine (a) and 5-ethyl-2-methylpyridine (b)

TOF MS技术利用特征离子的精确质量数进行分析，质量精度可达10-6级。结合原子组成的限定条件，可确定碎片离子的元素组成，进而实现目标物的定性。选择响应最高的碎片离子作为特征离子，根据测定的相对分子质量推测元素组成，结果列于表1。9种分析物的特征离子与理论质量数误差均小于5×10-6，在可接受的误差范围内。

综上分析，依据TOF MS得到吡嗪和吡啶类物质碎片离子的精确质量数据库，结合保留时间、碎片离子与反应原理的相符性识别等信息，可实现吡嗪和吡啶类物质的定性分析。

2.3 方法验证

测定了系列混合标准溶液，以离子的响应峰面积对质量浓度绘制标准曲线。将不含9种分析物的空白唾液样品按1.2.2节方法处理后，测定20次，分别以空白响应的3倍、10倍标准偏差确定检出限(LODs)、定量限(LOQs)。

在人工唾液样品中分别加入低、中、高3种混合标准溶液。吡啶的加标水平为20.0、100.0和400.0 μg/L；2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的加标水平均为4.0、20.0和80.0 μg/L；3-乙基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、2,3,5,6-四甲基吡嗪的加标水平均为1.0、5.0和20.0 μg/L。按优化的方法进行6次平行实验，计算回收率。9种分析物的线性方程、相关系数、检出限、定量限、回收率列于表3。结果表明：9种分析物的相关系数R2>0.999 1，定量限为3.0～7.9 μg/L，回收率在85%～104%之间，能够满足唾液中吡嗪和吡啶类物质的分析要求。

表3 唾液样品中9种分析物的线性方程、相关系数、检出限、定量限和回收率Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs, LOQs and recoveries of nine analytes in saliva sample

2.4 实际样品检测

选取6种市售卷烟样品(分别标记为A、B、C、D、E、F)进行检测，按照1.2.1节方法，每种卷烟采集6名吸食者唾液，分析不同卷烟样品吸食者唾液中吡嗪和吡啶类物质。结果表明：卷烟吸食者唾液中的吡啶类物质以吡啶为主，3-乙基吡啶和5-乙基-2-甲基吡啶均未检出(低于定量限)；卷烟吸食者唾液中的吡嗪类物质以2-甲基吡嗪为主，2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪有少量检出，而2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪只在A样品吸食者唾液中检出，平均含量分别为0.81 μg/L和0.73 μg/L。不同卷烟吸食者唾液中检出的主要吡嗪和吡啶含量以箱图示于图4。由图可见，不同卷烟样品吸食者唾液中吡啶和2-甲基吡嗪含量存在较大差异。

对以上6种卷烟吸食者唾液中吡嗪和吡啶类物质含量测定结果进行主成分分析，结果示于图5。从图可见，同种卷烟不同吸食者唾液中的吡嗪和吡啶类含量能够较好的聚类，卷烟A、D与其他卷烟差异较大。进一步通过单因素方差和Tukey多重比较检验分析，发现不同卷烟吸食者唾液中检出的吡嗪和吡啶类含量存在显著性差异(P<0.05)，这些物质可用于区分不同的卷烟风格。

注：a.吡啶;b.2-甲基吡嗪;c.2,5-二甲基吡嗪;d.2,6-二甲基吡嗪;e.2,3-二甲基吡嗪 图4 不同卷烟样品吸食者唾液中吡嗪和吡啶类物质含量箱图Fig.4 Box plots of pyrazines and pyridines contents in smokers’ saliva of different cigarettes

图5 6种卷烟样品吸食者唾液中吡嗪和吡啶类物质含量的主成分分析Fig.5 Principal component analysis diagram of pyrazines and pyridines content in smokers’ saliva of 6 kinds of cigarettes

3 结论

建立了气相色谱-正化学电离源-飞行时间质谱法(GC-PCI-TOF MS)检测烟草吸食者唾液中9种吡嗪和吡啶类物质，结合特征离子的保留时间、精确质量数、裂解规律对目标物进行定性鉴定，以外标法定量。9种目标物的线性相关系数R2大于0.9991，定量限为3.0～7.9 μg/L，回收率在85%～104%之间，该方法简单快速、检出限低、准确可靠。将该法用于实际样品检测，通过检测6种市售卷烟样品，发现烟草吸食者唾液中主要含有吡啶、2-甲基吡嗪和二甲基吡嗪类物质，且不同卷烟样品其吸食者唾液中的吡啶、2-甲基吡嗪含量存在差异。对不同卷烟样品吸食者唾液中吡嗪和吡啶类物质含量进行主成分分析，发现可以根据吸食者唾液中目标物含量将卷烟进行分类。该方法可为评价吡啶和吡嗪类物质对烟气感官质量的影响提供科学依据。