细菌生物被膜清除方法的研究进展

李金朋，李小康，樊擎莹，范泽钰，温文彦，汪 洋

（河南科技大学动物科技学院 畜禽分子病原与免疫学重点实验室，洛阳 471023）

细菌生物被膜是细菌的一种生存状态，是由一种或多种细菌为适应外界环境而形成的微菌落聚集体，其主要成分为胞外多糖蛋白复合物，将细菌自身包被其中，是细菌相互粘连形成具有特定结构的细菌复合体，形状如膜并附着于载体表面[1,2]（图1）。

细菌通过粘附（adherence）、聚集（accumulation）、成熟（maturation）、脱落（detachment）四个阶段形成生物被膜[3]（图2）。在细菌生物被膜形成初期，细菌需要粘附于载体表面，然后借助分泌的胞外多聚物相互粘附聚集，这是生物被膜形成的关键阶段。然后，细菌生物被膜逐渐“成熟”，最后随着酚溶性调节肽（phenol-soluble modilins，PSM）等物质作用，细菌从生物被膜脱落[4]。细菌形成的生物被膜在病原菌引起的持续性感染中起着重要作用。生物被膜状态下细菌对抗生素、免疫细胞、抗体都有极高的抗性[5,6]。生物被膜直接影响诸多方面：医疗内置物表面的生物被膜能引起慢性感染；牙齿表面生物被膜导致蛀牙。显然，有关细菌生物被膜清除方法的研究已成为当下热点。本文拟对细菌生物被膜清除方法的研究展开综述，旨在阐明清除细菌生物被膜的方法，更加重视细菌生物被膜清除方法在疾病预防和治疗中的重要作用，并结合现有的方法技术去研发新型的抗细菌生物被膜药物。

图1 猪链球菌生物被膜（扫描电镜图）Fig.1 Streptococcus suis biof i lm (SEM)

图2 生物被膜形成过程Fig.2 Biof i lm formation process1: 粘附期; 2: 聚集期; 3: 成熟期; 4: 脱落期1: Adherence stage; 2: Accumulate stage; 3:Mature stage;4: Detachment stage

1 细菌生物被膜清除的物理方法

随着物理工程技术飞速发展以及影像诊断技术革新，治疗生物被膜状态下细菌性疾病不再局限于传统抗生素。当前抗菌治疗主要依靠抗生素，但是治疗效果日渐下降，细菌耐药性问题已不可忽视[5]，亟须研发抗菌新方法。

1.1 超声波 超声波是一种频率高于20 000赫兹的弹性机械震荡，它的方向性好且穿透力强，可以集中获得声能。如今，超声作为一种安全、廉价、无创的物理医疗诊断手段，广泛应用于临床。早在20世纪90年代，有学者开展关于超声波与抗生素联合应用于细菌治疗的研究。随后，就超声波对生物被膜的作用开展了多方面研究，包括超声波的各种参数变量作用于不同的菌株等。

低频超声波联合抗生素能够有效地抑制或杀灭细菌生物被膜。刘丽婷等[7]研究发现，低频超声波单独作用于生物被膜时并不能对其产生影响，联合抗生素处理，能破坏生物被膜结构，杀菌作用显著增强。何年安等[8]研究表明，万古霉素和超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）联合应用于治疗生物被膜感染有显著的增强效果。Carmen等[9]研究表明，低频超声波能使抗生素治疗生物被膜感染的效果显著增强，且对表皮葡萄球菌生物被膜清除起到促进作用。此外，Pitt等[10]研究表明，低频超声波联合庆大霉素能够对游离的铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌产生很好的杀灭效果。超声波的作用机制目前还没有研究透彻，多数学者认为超声波作为弹性机械震荡，能在机体产生高压、高剪切力，加强细胞间的微对流，增高局部温度，同时增强细菌细胞壁及细菌生物被膜对药物的通透性，进而增强药物的作用能力，起到辅助治疗作用。

1.2 电击法 电流可以影响细菌生物被膜结构中菌体数量[11]。研究显示，微弱的电流能有效减弱手术器械表面细菌生物被膜的形成，同时能够显著增强抗生素的杀菌效果。Caubet等[12]研究发现，10 MHZ的射频电流能够显著增强庆大霉素和土霉素等药物对生物被膜的作用。有学者研究发现，将生物被膜暴露在6 V电压的环路中几分钟，两极生物被膜菌体可减少10 000倍，这预示着电击法或许可以成为治愈细菌生物被膜感染的有效方法[13]。

2 细菌生物被膜清除的化学方法

2.1 金属螯合物 钙、铁、钡、镁、铜等会对生物被膜的形成产生影响，高浓度的铁能促进生物被膜的发展，是生物被膜形成三维结构必需的元素[14]。乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）具有杀菌活性，能够促进细胞脂多糖的释放，从而杀死浮游菌。此外，EDTA通过与二价金属阳离子结合，作用于生物被膜，对其分散杀灭。体外实验研究显示[15]，用EDTA作用培养基中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物被膜，其活性是庆大霉素的1000倍，说明EDTA是高效的生物被膜分散剂和杀菌剂。如果联合使用EDTA和庆大霉素，则可以完全清除Tris缓冲液中铜绿假单胞菌生物被膜。共聚焦显微镜观察发现，EDTA导致铜绿假单胞菌生物被膜内部解离，同时庆大霉素杀死生物被膜外部及分散出来的铜绿假单胞菌[16]。此外，研究表明腹腔注射EDTA与环丙沙星联合应用，能显著清除豚鼠肺部生物被膜感染，且动物体内未见明显毒副作用[17]。

2.2 表面活性剂 鼠李糖脂（Rhamnolipid）是由假单胞菌属（Pseudomonas）的一些菌株合成的表面活性剂，可以加快铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的脱落速度，从而破坏已形成的生物被膜[18]。研究发现，铜绿假单胞菌的鼠李糖脂可促进伯德特分枝杆菌（Mycobacterium burdette）生物被膜的放散，从而支持了鼠李糖脂或其他生物活性剂可作为一种抗细菌生物被膜物质，应用于辅助抗生素治疗生物被膜的感染。

3 生物方法

3.1 联合使用抗菌药物 近年来，抗生素大量使用导致细菌耐药性增加且生物被膜普遍具有耐药性，使用单一抗菌药物难以清除细菌生物被膜，从而导致感染迁延不愈，治疗失败，同时细菌对抗菌药物产生广泛耐药性[19]。目前认为，联合使用抗菌药物有利于其瓦解细菌生物被膜，能有效治疗生物被膜感染。

李蓉等[20]研究发现，用高分子滤膜琼脂培养法可制备肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）生物被膜，庆大霉素、环丙沙星联合使用能显著增强对肺炎克雷伯菌生物被膜的杀灭。进一步研究发现，大环内酯类抗生素与氟喹诺酮类抗菌药物联合使用可做为控制铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等生物被膜感染的有效方法。万珍艳等[21]通过红霉素联合环丙沙星雾化吸入实验，在大鼠体内气管插管，建立铜绿假单胞菌生物被膜呼吸道感染模型，电镜观察导管上生物被膜，发现联合用药组导管内表面细菌生物被膜明显减少。磷霉素、氟喹诺酮类抗菌药物联合应用同大环内酯、氟喹诺酮类药物联合应用的效果相似。

3.2 抗生素衍生物 治疗细菌生物被膜的化学合成物，主要是一些临床上的抗生素衍生物和四氢噻唑酮类化合物、氨基咪唑类化合物、4-吡唑重氮类衍生物等。有研究表明生物被膜对抗菌药物的抵抗力比浮游的非生物被膜细菌强1000倍[22]。Cafiso等[23]研究表明，左氧氟沙星、妥布霉素、替吉环素、达托霉素、利奈唑胺、利福平等药物对葡萄球菌生物被膜只能起到抑制粘连的作用，而不能杀灭。可见，寻找抗生素的衍生物和化学合成物也是一条可循之路。Le等[24]研究表明，125 mg/L的莫匹罗星可以使金黄色葡萄球菌生物被膜减少90%以上体积，而安全剂量范围内的环丙沙星和万古霉素很难达到相同的效果。Mina等[25]研究表明，三氯生联合环丙沙星同样可以减少90%以上的生物被膜，这提示两者具有协同作用。2-氨基咪唑类衍生物能够显著地抑制生物被膜的发生和生长，而4-吡唑重氮类衍生物对白色链珠菌生物被膜具有抑制效果。同时，含有羧酸基团的四氢噻唑类衍生物在低浓度下即对生物被膜具有良好的抑制效果。

3.3 天然产物 天然产物是指一些由生物提取或者合成，具有药理和生理特性的天然提取物，广义上的天然产物甚至包括一些完全由人工合成的化合物。从天然产物中发现、提取防治细菌感染的有效成分，是新药开发中一项极为重要的途径。近年来，随着中药开发和海洋探索，利用陆地植物和海洋产物提取抗细菌生物被膜的物质，取得丰硕的成果（表1）。

植物是天然药物以及天然先导化合物最广泛的来源，现已发现的很多天然产物对生物被膜的防治有很显著的效果。产自北美洲的水果——酸果蔓果实（cranberry）提取物可以抑制大肠杆菌引起的泌尿疾病，从而防止尿路感染。Feldman等[26]研究表明，酸果蔓果实提取物通过竞争自发性诱导剂与感应器（spontaneous inducer and inductor）的结合，干扰细菌的群体感应。与此类似，蔓越莓、绿茶、红葱等提取物也可以通过干扰细菌的群体感应而达到抑制细菌生物被膜生长的目的。Hu等[27]研究发现，柿树属植物（Diospyros dendo）的提取物可以对铜绿假单胞菌PA01形成的生物被膜产生抑制作用。Tomczyk等[28]研究表明，蕨麻的提取物，具体说是多酚成分，对远缘链球菌GCM 20381生物被膜具有抑制活性作用。另有学者研究发现，大红钓钟柳的提取物（苯乙醇苷类糖苷、环烯醚萜苷、毛蕊花苷）可以很好地抑制大肠杆菌生物被膜的形成[29]。由于植物提取物在抗细菌生物被膜方面的研究历史短暂，很多植物提取物的抗生物被膜机理并不清楚，有待进一步的研究。

表1 植物天然产物汇总表Table 1 Summary table of plant natural products

近年来，随着海洋开发，从海洋生物中寻找新型先导化合物已成为抗细菌生物被膜研究的突破口。珊瑚、海绵动物、鱼类和海洋微生物含有丰富的潜在资源。所以，从海洋生物中探索抗生物被膜活性成分，应着眼于以上几种海洋生物的开发研究。Pandian等[34]研究发现，珊瑚提取物无论在体内还是体外，对金黄色葡萄球菌所形成的生物被膜有良好的抑制作用。此外，从海洋微生物乳酪短杆菌MSA19中分离的糖脂类生物表面活性剂可以在动态条件下干扰生物被膜的形成，不仅如此，MSA19还具有广谱抗生物被膜活性。海绵（sponge）同样是寻求抗生物被膜活性成分的目标之一。Dash等[35]通过大量研究，从7种海绵中粗提出4种具有抗生物被膜活性物质。此外，Schillaci等[36]研究还发现，海胆免疫系统的效应细胞存在一种具有广谱抗菌效果的物质。

4 结语

目前，研究人员在细菌生物被膜感染和生物被膜形成防治方面已提出不少方法和见解。然而，大多数抗生物被膜活性成分不足以完全抑制或杀灭细菌生物被膜，而且缺乏广谱抗生物被膜制剂。由于研究时间短，目前对于生物被膜形成以及抑制或杀灭生物被膜的分子机制尚不十分明晰，研究还处在探索阶段[37-39]。但在目前的研究中也有新发现，如化学合成类化合物、植物提取物等的研究已显示出抵抗生物被膜的良好效果。随着对生物被膜形成机制认识不断深入，分析方法的提高以及现代生物医药技术的不断进步，对细菌生物被膜的理解将更加透彻，从而可以更有效地治疗细菌生物被膜引起的疾病。