毛细管气相色谱法测定吉非替尼原料药中残留有机溶剂

郑荣杰

(广东省第二人民医院药学部，广州 510317)

吉非替尼化学名为N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺，又名易瑞沙，化学结构见图1。由阿斯利康制药有限公司研制，2003年在美国上市，该药是一种口服的、选择性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，其作用机制是阻断肿瘤细胞增殖、存活的信号转导通路和其他促进癌细胞扩散的相关过程[1]。在吉非替尼的合成和精制过程中由于使用了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯等有机溶剂，因此在制定质量标准时必须考察该原料药中有机溶剂的残留问题[2-5]。根据《中国药典》和人用药品注册技术规范国际协调会(ICH)关于药品中有机溶剂残留量测定的指导原则，二氯甲烷属于避免溶剂，质量浓度限量为5mg·L-1，甲醇属于限制溶剂，质量浓度限量为5000mg·L-1，乙醇、丙酮和乙酸乙酯属于低潜在毒性溶剂，质量浓度限量小于5mg·L-1[6-7]。本文采用毛细管气相色谱法[8-12]同时对甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯5种残留溶剂进行检测[13-21]，操作简便、重复性好、结果准确可靠，可作为进一步研究吉非替尼质量标准的可行方法。

图1吉非替尼结构

Fig.1 Structure of gefitinib

1 仪器与试药

1.1仪器 GC-2010气相色谱仪，包括SHMADZU AOC-20i 自动进样器，AUY120分析天平(日本岛津公司)。

1.2试药 吉非替尼(批号：201402001，201402002，201402003，201404001，201404002，201404003)由广东药科大学药物化学系提供。二甲基亚砜(GC级)，甲醇(色谱纯)，德国默克公司；乙醇、乙酸乙酯(GC级)，阿拉丁试剂有限公司；丙酮(GC级)，二氯甲烷(分析纯)，广州化学试剂厂。实验用水为超纯水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：采用石英毛细管柱Rtx-624(60 mm×0.32 mm，1.8 μm)；柱温：60 ℃，以5 ℃·min-1的速率升温至80 ℃，保持2 min，以100 ℃·min-1的速率升温至200 ℃，保持4 min；进样口温度：200 ℃；氢火焰离子化检测器，检测器温度：250 ℃；载气：氮气；流速：3.0 mL·min-1；进样量：1.0 μL。

2.2溶液的配制 空白溶液：精密量取DMSO 3 mL，置于顶空进样瓶中，作为空白溶液。

混合对照品溶液：取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯对照品适量，用DMSO溶解配制成含甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯质量浓度分别为3，4.96，4.96，0.64和4.96 mg·mL-1的溶液作为对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用DMSO稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

供试品溶液：取本品1 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，用DMSO稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3系统适用性实验 取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯适量，加DMSO溶解，稀释成质量浓度分别为120.2，198.4，198.7，25.44和198.8 μg·mL-1的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，取2.2项下制备的混合对照品溶液和供试品溶液各1 μL，分别进样，各连续进样5次，结果混合对照品溶液中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯与DMSO分离良好，空白溶剂无干扰，见图2和表1。

图2GC图

A.空白溶剂；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.丙酮；4.二氯甲烷；5.乙酸乙酯。

Fig.2 GC chomatograms

A.blank solvent；B.mixed reference solution；C.sample solution；1.methanol；2.ethanol；3.acetone；4.dichloromethane；5.ethyl acetate.

2.4检测限、定量限实验 取各溶剂适量,用DMSO逐级稀释至S/N=10时的质量浓度为其定量限，稀释至S/N=3时的质量浓度为其检测限，结果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的检测限分别为0.379 7,0.379 2,0.215 2,0.826 8和0.288 6 μg·mL-1；定量限分别为0.795 4,0.758 5,0.430 1,1.653 0和0.577 1 μg·mL-1。

2.5线性关系考察 分别精密量取2.2项下制备的对照品储备液0.4，0.8，1.0，1.2，1.5和2.0 mL，置于25 mL量瓶中，用DMSO稀释至刻度，摇匀。取上述溶液各3 mL，置于顶空进样瓶中，按照2.1项下色谱条件分别进样，以峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)，进行线性回归，其线性关系见表2。

表1系统适用性实验结果

Tab.1 The test results of the system test

溶剂甲醇乙醇丙酮二氯甲烷乙酸乙酯峰面积149 888.0419 521.1446 856.913 585.1332 141.0148 033.1412 162.5428 362.213 862.3327 029.2144 886.2404 377.2429 036.113 493.7327 959.5144 066.5402 746.0426 995.413 973.9326 741.0147 408.9413 151.3438 152.614 009.2335 015.3平均峰面积146 856.54410 391.62433 880.6413 784.84329 777.2RSD/%0.20.20.20.20.1理论塔板数8 915.512 395.282 114.58 825.415 774.7

2.6精密度实验

2.6.1方法精密度 称取吉非替尼供试品适量，配制成质量浓度为40 mg·mL-1的6份吉非替尼供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，样品中的残留溶剂甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分别为0%，0%，1.8%，0%和0%，结果表明，该方法精密度良好。

表25种残留溶剂的线性方程及范围

Tab.2 Linear relationships and ranges of the 5 residual solvents

溶剂质量浓度范围/μg·mL-1线性关系r甲醇48.08^240.4y=1 300 000x-251.300.999 1乙醇79.39^396.8y=750 000x-284.840.999 4丙酮79.48^397.4y=2 300 000x-349.300.999 6二氯甲烷10.18^50.88y=530 000x+125.010.999 2乙酸乙酯79.48^397.4y=2 200 000x+306.230.999 1

2.6.2中间精密度 分别配制6份质量浓度为40 mg·mL-1的吉非替尼供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，样品中的残留溶剂甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分别为0%，0%，1.4%，0%和0%，结果表明，中间精密度良好。

2.7耐用性实验 改变气相色谱条件中的起始温度(±10 ℃)和流速(±0.2 mL·min-1)，各溶剂峰的分离度均大于2.0%，结果表明，该方法耐用性良好。

2.8回收率实验 精密称取供试品0.4 g，共10份，置于10 mL量瓶中，其中1份加10 mL DMSO，作为空白溶液，其余9份均分成3组，分别加入2.3项下制备的混合对照品溶液0.5，1.0和1.5 mL，加DMSO定容至刻度，按照2.1项下色谱条件测定，计算回收率，结果均符合要求，见表3。

表35种有机溶剂的回收率实验结果

Tab.3 Results of recovery tests of the 5 residual solvents(n=3)

溶剂 回收率/%80%溶液100%溶液120%溶液平均回收率/%RSD/%甲醇97.298.498.197.90.64乙醇100.4100.499.8100.20.35丙酮98.398.399.598.70.71二氯乙烷102.9100.3100.4101.21.46乙酸乙酯101.597.1101.6100.12.57

2.9样品中有机溶剂残留量的测定 取吉非替尼样品6批，用DMSO配制成质量浓度为40 mg·mL-1的供试品溶液，另取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯对照品，配制成质量浓度分别120.2，198.4，198.7，25.44和198.8 μg· mL-1的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，采用峰面积外标法进行计算，批号201402001，201402002，201402003，201404001，201404002和201404003的样品中丙酮残留含量分别为0.935 4,1.215 4,1.315 4,0.894 1,1.298 9和1.529 0；各批号均未检出甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯。6批样品中残留溶剂的含量均小于混合溶剂对照品的量(限量)，产品符合要求。

3 讨论

本文通过对色谱柱和柱温进行考察，结果表明，采用中性色谱柱Rtx-624，起始温度60 ℃，维持8 min，以5 ℃·min-1上升至80 ℃，维持2 min，以100 ℃· min-1上升至200 ℃，维持4 min，进样口温度200 ℃，流速3.0 mL·min-1，在此气相色谱条件对该5种溶剂进行测定，各溶剂峰分离度大于2.0，方法耐用性良好。在限量40%～200%范围内，线性关系良好，线性系数大于0.999 1，其准确度实验回收率的RSD值为97.9%～101.2%，方法准确度良好。由于本方法采用丙酮干燥，因此，在吉非替尼样品中存在少量丙酮，其含量低于限量，样品合格。

《中国药典》规定，甲醇和二氯甲烷属于第二类溶剂，其限度分别为0.3%和0.066%，乙醇、丙酮和乙酸乙酯属于第三类溶剂，其限度均为0.5%。本实验采用峰面积外标法对吉非替尼样品中的残留溶剂进行测定，要求吉非替尼样品中各溶剂残留的峰面积均小于溶剂对照品的峰面积。

经过上述验证，表明本文建立的方法线性、精密度、回收率、定量限、检测限以及系统适用性实验结果均较好，能够准确、迅速地检测出吉非替尼原料药中残留的甲醇、乙醇、丙酮、二氯乙烷和乙酸乙酯，从而保证用药的安全性。