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助孕丸的质量标准研究

2018-07-21周楚娟梁芷韵黄月纯

西北药学杂志 2018年4期
关键词:女贞子女贞批号

廖 娴,周楚娟,梁芷韵,黄月纯

(1.广州中医药大学第一附属医院,广州 510405;2.广州中医药大学第一临床医学院,广州 510006)

助孕丸是广州中医药大学第一附属医院的医院制剂,原方是由女贞子、黄芪、白术、党参和续断等8味中药组成的复方制剂。有健脾固肾之功效,主治脾肾两虚之胎漏胎动不安等症,临床应用效果较好,受到广大患者欢迎。方中黄芪具有补气升阳、固表止汗等功效[1],主要含有多糖、黄酮类、皂苷类及氨基酸等化学成分[2-4]。女贞子来源于木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实,有滋补肝肾、明目乌发的功效[1]。现代药学研究发现,女贞子含有多种类型的化合物,其中主要的有效成分有齐墩果酸、特女贞苷和红景天苷等,具有抗肿瘤、调节免疫功能、护肝和降血脂等生物活性[5-6]。特女贞苷为化合物中的环烯醚萜类[7-8]。《中国药典》2015年版一部关于女贞子的含量测定以特女贞苷为指标。目前,助孕丸的检测标准为性状及相关丸剂项下检查,缺乏相关的定性和定量指标。为有效控制助孕丸的质量,作者对方中以粉末入药的党参、白术和续断进行了显微鉴别,对主要药味黄芪和女贞子分别进行了TLC定性和液相定量研究,初步建立了专属性强、稳定可靠的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(包括DAD检测器和 Agilent 1200色谱工作站),美国 Agilent 公司;Olympus CX41显微摄像仪(日本奥林巴斯公司);CAMAG Linomat-5半自动点样仪,CAMAG ADC2全自动展开仪(瑞士卡玛公司);硅胶G预制板(青岛海洋化工厂);HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司);XA105型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 黄芪对照药材(批号120974-200508)、特女贞苷对照品(批号111926-201401),均由中国食品药品检定研究院提供。助孕丸(批号:160601,161001,161101,制剂中心自制);甲醇为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1显微鉴别 取本品,研细,置于显微镜下观察:联结乳管直径12~15 μm,含细小颗粒物(党参)[9-10]。草酸钙针晶细小,长10~32 μm,不规则地填塞于薄壁细胞中(白术)[11]。草酸钙簇晶直径至45 μm,存在于淡黄棕色皱缩的薄壁细胞中,常数个排列成行(续断)[12]。结果见图1。

图1显微鉴别结果

A.联结乳管(党参);B.草酸钙簇晶(续断);C.草酸钙针晶(白术)。

Fig.1 Results of microscopic identification

A.connecting tube (Radixcodonopsis);B.calcium oxalate cluster crystal (Radixdipsaci);C.calcium acicular crystal (RhizomaAtractylodismacrocephala).

2.2TLC鉴别 取助孕丸5 g,研细,加50 mL乙醇加热回流20 min,滤过,滤液蒸干,残渣加质量浓度为3 g·L-1的氢氧化钠溶液15 mL使溶解,滤过,滤液用稀盐酸调节pH值至5~6,用乙酸乙酯15 mL振摇提取,分取乙酸乙酯液,用铺有无水硫酸钠适量的滤纸滤过,蒸干滤液,残渣加1 mL乙酸乙酯溶解,即得。取处方中缺黄芪的阴性对照样品5 g,按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。另取2 g黄芪对照药材,用上述方法制成对照药材溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)实验[1],吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL,分别点在同一硅胶G薄层板上,用三氯甲烷-甲醇(10∶1)作为展开剂,展开,取出,晾干,置于氨蒸气中熏后,在紫外光灯365 nm处检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色荧光主斑点,阴性样品无干扰。见图2。

图2黄芪TLC图

1.黄芪对照药材;2~4.供试品(批号161101);5.黄芪阴性对照。

Fig.2 TLC chromatogram of RadixAstragali

1.RadixAstragalireference substance;2-4.samples (batch number 161101);5.negative control.

2.3含量测定

2.3.1色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(30∶70)[13];检测波长:224 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

2.3.2对照品溶液的制备 取特女贞苷对照品13.20 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成质量浓度为1.320 g·L-1的对照品储备液,精密量取1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得特女贞苷对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 取助孕丸粉末2.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入50 mL稀乙醇溶液,称定质量,超声处理20 min,冷却至室温,再称定质量,用稀乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.3.4专属性实验 取女贞子阴性对照样品2.0 g,精密称定,按照2.3.3项下方法,制得女贞子阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL,注入液相色谱仪,按照2.3.1项下色谱条件测定,结果阴性对照在特女贞苷峰相同保留时间位置上未见色谱峰,说明阴性样品对特女贞苷含量测定无干扰,见图3。

图3助孕丸HPLC图

A.对照品;B.供试品;C.阴性样品;1.特女贞苷。

Fig.3 HPLC chromatograms of Zhuyun Pills

A.reference substance;B.sample;C.negative sample;1.specnuezhenide.

2.3.5线性关系考察 分别精密吸取质量浓度为1.320 g·L-1的特女贞苷对照品储备液0.2,0.5,1.0,1.5和2.0 mL,置于10 mL 量瓶中,分别加甲醇定容至刻度,分别精密吸取10 μL 注入液相色谱仪,测定峰面积。按照2.3.1项下色谱条件进样分析,测定峰面积。以进样量为横坐标(x)、色谱峰面积为纵坐标(y)进行线性回归。特女贞苷的回归方程及相关系数为:y=1 157.3x-20.591(r=0.999 8)。结果表明,特女贞苷在0.264 0~2.640 μg范围内线性关系良好。

2.3.6精密度实验 精密吸取特女贞苷对照品溶液10 μL,按照2.3.1项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积RSD值为0.38%,结果表明,仪器精密度良好。

2.3.7重复性实验 取样品(批号160601)6份,分别按照2.3.3项下方法制备供试品溶液,进样分析,结果特女贞苷的平均含量为1.668 mg·g-1,RSD值为1.12%。结果表明,该实验重复性良好。

2.3.8稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL,分别于0,2,4,8,12和24 h后进样分析,测定峰面积,结果特女贞苷峰面积的RSD值为1.01%(n=6),表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9回收率实验 精密称取已知含量的样品(批号160601)6份,每份1.0 g,分别加入质量浓度为321.2 μg·mL-1的特女贞苷对照品溶液各5 mL,按照2.3.3项下方法制备供试品溶液,进样分析,计算加样回收率,结果见表1。

表1特女贞苷加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery test of specnuezhenide(n=6)

取样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.0021.6711.6063.24197.76 98.11.561.0041.6751.6063.25198.13 1.0051.6761.6063.21595.83 1.0111.6861.6063.25697.76 1.0051.6761.6063.25998.57 1.0131.6901.6063.305100.56

2.3.10样品测定 分别取各批号样品2 g,每批平行操作2次,共6份,精密称定。分别按照2.3.3和2.3.2项下方法制备供试品溶液和对照品溶液,分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10 μL,注入液相色谱仪,按照2.3.1项下色谱条件测定,结果3批样品中特女贞苷的平均含量分别为1.668,1.673和1.677 mg·g-1。

3 讨论

3.1显微鉴别 本制剂中党参、白术和续断为直接粉碎后粉末入药,因此显微鉴别的专属性和稳定性对制剂的鉴别具有重要意义[14]。在显微鉴别研究中,党参的联结乳管、白术的草酸钙针晶和续断的草酸钙簇晶均是具有代表性的显微结构,专属性强、显微特征清晰、稳定性高,故列入标准。

3.2TLC鉴别 在TLC鉴别实验中,参考药典及文献方法进行TLC鉴别研究[15-16],以黄芪甲苷为对照品,但黄芪甲苷斑点不清晰,且阴性有干扰。后参考以黄芪对照药材为对照的TLC方法[1],以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂,展开,置于氨蒸气中熏后,置于紫外光灯365 nm处检视。实验结果显示,供试品色谱中斑点清晰,阴性对照无干扰。考察了不同点样量(5和10 μL)、不同薄层板(青岛海洋化工厂硅胶G板和烟台市化学工业研究所硅胶G板)、不同温度(6,25和30 ℃)及不同湿度(33%,55%和75%)对黄芪TLC鉴别的影响,结果表明,点样量为10 μL,点于青岛海洋化工厂硅胶G板时效果较好,而温度和湿度对黄芪TLC色谱展开的影响相对较小。通过对不同批次的供试品进行分析,表明本实验建立的黄芪TLC鉴别方法斑点清晰、专属性强、耐用性好,可用于该制剂的质量控制。

3.3含量测定 在女贞子的含量测定研究中,大多数以齐墩果酸为指标[17-19],而特女贞苷对测量女贞子更具有专属性[13]。在供试品溶液的制备中,比较了甲醇、稀乙醇和体积分数为75%的乙醇等不同溶媒提取方法,结果稀乙醇的提取效率较高,因此确定了稀乙醇为提取溶剂。同时,对加热回流1 h和超声处理20和30 min的不同提取方法进行了比较分析,结果所测含量无明显差异,故选用较简单的超声处理20 min作为提取方法。参考药典及文献[13,20],女贞子项下含量测定方法选用流动相为甲醇-水,分离效果较好,能达到分离要求。

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