环糊精水提法提取积雪草中的三萜类化合物

常 春，赵亚南，曾爱国

(1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.陕西省食品药品监督检验研究院，西安 710065)

积雪草为伞形科植物Centellaasiatica(L.)Urb.的干燥全草，性苦、寒，味辛，归肝、脾、肾经，具有清热利湿、解毒消肿的功效，临床上用于湿热黄疸、中暑腹泻、石淋血淋、痈肿疮毒和跌扑损伤[1]。现代药理研究发现，积雪草具有抗抑郁[2]、抗肿瘤[3]、修复皮肤系统[4]、抗胃溃疡[5]和保护心血管系统[6]等作用。积雪草的化学成分主要有三萜类、多炔烯烃类、黄酮类和挥发油类，还含有绿原酸、内消旋肌醇、黄酮醇、脂肪酸、天胡姜碱、叶绿素、烃类、木脂素类、糖、鞣质和多元酚类等成分[7-8]。三萜类化合物是积雪草发挥药理作用的主要活性成分，主要包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草苷-B、积雪草酸和羟基积雪草酸5种化合物[8-9]。目前，积雪草三萜类化合物主要采用乙醇提取，但会污染环境、成本较高，且具有一定的危险性[10-11]。

环糊精(cyclodextrin，CD)作为一种环状低聚糖，具有内疏水、外亲水的空腔，可与多数化合物结合成主客体包合物，从而增加化合物的溶解度和生物利用度[12-13]。近年来，采用环糊精提取中药活性成分的研究逐渐增多，取得了较理想的结果[14-15]。与有机溶剂提取相比，环糊精提取法以水为溶剂，具有安全、经济和环保的特点。本文以环糊精水溶液作为提取溶剂，采取回流法提取积雪草中三萜类化合物，并研究环糊精种类、环糊精浓度、料液比、药材粒度及提取时间对提取的影响。

1 仪器与试药

1.1仪器 高效液相色谱仪，包括LC-20A泵、SPD-20A检测器和LC solution色谱工作站，AUY220型电子天平(日本岛津公司)；AT-330型柱温箱(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-3型循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂)；DF-101S型恒温水浴锅(河南省予华仪器有限公司)。

1.2试药 羟基积雪草苷(质量分数>99%)，积雪草苷(质量分数>99%)，积雪草苷-B(质量分数>99%)，积雪草酸(质量分数>95%)和羟基积雪草酸(质量分数>98%)，均购自西安开来生物工程有限公司；α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD，均购自南京森贝伽生物技术有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；三蒸水(自制)；积雪草药材，购自西安市南郊药材市场，经西安交通大学药学院郭增军教授鉴定为伞形科植物积雪草Centellaasiatica(L.)Urb.的干燥全草。

2 方法

2.1环糊精水提法 精密称取积雪草粉末2 g，置于圆底烧瓶中，再加入适量环糊精水溶液，加热回流提取。

2.2索氏提取法 精密称取积雪草粉末(过6号筛)2 g，加适量石油醚，索氏提取6 h，弃去石油醚；再加入适量乙醇提取5 h，至溶液颜色不再加深，移至蒸发皿中，蒸干；加适量水制成混悬液，再加入水饱和的正丁醇萃取3次；正丁醇液蒸干，用适量甲醇溶解。

2.3含量测定方法

2.3.1对照溶液的配制 分别精密称取积雪草苷对照品、积雪草苷-B对照品、羟基积雪草苷对照品、羟基积雪草酸对照品和积雪草酸对照品分别10，10，10，4和2 mg，置于同一20 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，将上述混合对照溶液逐级稀释，得到积雪草苷、积雪草苷-B、羟基积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸质量浓度分别为5～500，5～500，5～500，2～200和1～100 μg·mL-1的系列溶液。

2.3.2样品溶液的配制 取2.1或2.2项下方法制备的提取液过滤，取续滤液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样分析。

2.3.3色谱条件 色谱柱：TIANHE Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水溶液(含2 mL·L-1磷酸)(25∶75)；柱温：30 ℃；检测波长：205 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。混合对照品与积雪草样品色谱图见图1。

图1HPLC图

a.积雪草样品；b.混合对照品；1.积雪草苷；2.积雪草苷-B；3.羟基积雪草苷；4.羟基积雪草酸；5.积雪草酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

a.Centellaasiaticasample；b.mixed standard solution；1.asiaticoside；2.asiaticoside B；3.madecassoside；4.madecassic acid；5.asiatic acid.

3 结果

3.1环糊精种类 称取适量α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD，分别用三蒸水溶解，制得含α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD浓度均为20 mmol·L-1的环糊精水溶液。称取积雪草粉末(过3号筛)2 g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶10(g·mL-1)加入环糊精水溶液，加热回流提取1 h。比较α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD对积雪草三萜类化合物提取率的影响，见图2。

图2不同环糊精对积雪草三萜类化合物提取的影响

Fig.2 Effects of different cyclodextrins on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由图2可知，当采用α-CD、β-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD提取时，羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率极低；而采用γ-CD提取时，羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率较高。采用β-CD、HP-β-CD、γ-CD和Glu-β-CD提取时，积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷的提取率较高，且相差较小；而采用α-CD提取时，积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷的提取率较低。相对于α-CD、β-CD、Glu-β-CD和HP-β-CD 4种环糊精，γ-CD对积雪草中5种三萜类化合物的提取率均较高，因此选择γ-CD提取积雪草三萜类化合物。

3.2γ-CD的浓度 称取适量γ-CD，配制成浓度分别为10，15，20，25和30 mmol·L-1的γ-CD水溶液。称取积雪草粉末(过3号筛)2 g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶10(g·mL-1)加入环糊精水溶液，加热回流提取1 h。考察γ-CD浓度对积雪草三萜类化合物提取效率的影响，见图3。

图3γ-CD浓度对积雪草三萜类化合物提取的影响

Fig.3 Effects ofγ-CD concentration on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由图3可知，积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷在10～30 mmol·L-1γ-CD水溶液中的提取率保持在稳定的水平；而羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率随着γ-CD浓度的增加先增大后减小，在γ-CD浓度为15 mmol·L-1时最大。因此，选择γ-CD的浓度为15 mmol·L-1。

3.3料液比 称取积雪草粉末(过3号筛)2 g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30(g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加热回流提取1 h。考察料液比对积雪草三萜类化合物提取率的影响，见图4。

图4料液比对积雪草三萜类化合物提取的影响

Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由图4可知，积雪草酸和羟基积雪草酸的提取率随着料液比的增加而增加，羟基积雪草苷的提取率呈降低趋势，积雪草苷和积雪草苷-B的提取率在料液比为1∶20～1∶30之间差别不大。在料液比为1∶20时，5种三萜类化合物的提取率均较高，因此料液比选择1∶20(g·mL-1)。

3.4提取时间 称取积雪草粉末(过3号筛)2 g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶20 (g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加热回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和5.0 h。考察提取时间对积雪草三萜类化合物提取率的影响，见图5。

图5提取时间对积雪草三萜类化合物提取的影响

Fig.5 Effects of extracting time on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由图5可知，提取时间对积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷的提取率影响不明显，但羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率随提取时间的增加而减小。提取时间为1.0 h时，5种三萜类化合物的提取率均较高，因此提取时间选择1.0 h。

3.5粒度 称取一定粒度的积雪草粉末2 g，置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶20 (g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加热回流提取1 h。考察药材粒度对积雪草三萜类化合物提取率的影响，见图6。

图6药材粒度对积雪草三萜类化合物提取的影响

Fig.6 Effects of particle size on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由图6可知，积雪草三萜类化合物的提取率随着药材粒度的减小而增加，因此本实验选择过6号筛的积雪草粉末。

3.6环糊精水提法与索氏提取法比较 分别采用优化的环糊精水提工艺和索氏提取法对积雪草进行提取，比较积雪草苷、积雪草苷-B、羟基积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率。在索氏提取法中，积雪草苷、积雪草苷-B、羟基积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率分别为3.76，1.44，1.71，2.60和2.47 mg·g-1；在环糊精水提法中，5种三萜类化合物的提取率分别为1.58，1.36，1.87，3.61和1.49 mg·g-1。由此可见，环糊精水提法中羟基积雪草苷和羟基积雪草酸的提取率高于索氏提取法，而积雪草苷、积雪草苷-B和积雪草酸的提取率低于索氏提取法。

4 结论与讨论

以环糊精水溶液作为提取溶剂，采取回流法提取积雪草中的三萜类化合物，研究环糊精种类、环糊精浓度、料液比、药材粒度及提取时间等因素对提取率的影响。结果表明，积雪草三萜类化合物的最佳提取条件为γ-CD 15 mmol·L-1，药材粒度为过6号筛，料液比选择1∶20(g·mL-1)，提取时间为1.0 h。

环糊精是经葡萄糖糖基转移酶发酵后得到的由α-1，4-葡萄糖苷键连接若干个D-吡喃葡萄糖单元形成的环状低聚物，其具内疏水、外亲水的空腔，可与许多物质(客分子)结合成主客体包合物，在制剂开发、药物分析、生物传感器、合成人造酶、化妆品和食品科技等方面的应用越来越广泛。环糊精与客分子形成主客体包合物时，客体分子的大小、形状应与环糊精的内腔相匹配。积雪草三萜类成分主要是五环三萜骨架的化合物，分子体积和相对分子质量较大，与内腔较大的γ-CD匹配性较好。因此，相对于α-CD、β-CD、Glu-β-CD和HP-β-CD 4种环糊精，γ-CD对积雪草中5种三萜类化合物的提取率较高。此外，环糊精的内腔疏水，因此客分子的极性也影响主客体包合物的形成和稳定。一般情况下，客分子的极性越小，越易形成主客体包合物，主客体包合物越稳定。因此，环糊精水提法中，极性较小的羟基积雪草酸和积雪草酸的提取率相对较高；而极性较大的积雪草苷和积雪草苷-B的提取率相对较小。

环糊精水提法可将积雪草三萜类化合物的提取和包合过程一步完成，简化工艺，对开拓积雪草三萜类化合物在药学方面的应用是有意义的尝试；且本方法以水作为溶剂，具有安全、经济和环保的优点。