HPLC法同时测定绿袍散中靛蓝与靛玉红

牛宇东，张 鑫，葛西航

(1.西安市食品药品检验所，西安 710054；2.陕西大德医药有限公司，西安 710075)

绿袍散是由青黛、黄柏、山豆根、薄荷、黄连、儿茶、人中白、硼砂和冰片[1]9味药研成细粉制成的散剂，主治唇舌糜烂、咽喉肿痛等，具有清热降火、消肿止痛的作用。方中青黛为君药，具有清热解毒、清肝泻火的作用[2-3]，再配以黄柏、黄连可清热燥湿、降火解毒[4-5]。由于青黛药材加工复杂，产量低，易出现掺假造假染色等现象，会影响药效，目前绿袍散仅有几个简单的化学反应和散剂的通则作为其质量控制标准。笔者认为该标准具有一定的缺陷，定性鉴别不能反映药品的真实质量，因此对处方中君药青黛增加含量测定项目。青黛的主要活性成分为靛蓝和靛玉红，目前对其测定主要有TLC扫描法[6-8]，紫外分光光度法[9-11]和HPLC法[12-18]等，本实验参考上述文献和《中国药典》[19]，拟建立同时测定绿袍散中靛蓝和靛玉红的含量，作为成药中青黛的质量控制方法，可以更全面地反映绿袍散的质量。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，四元洗脱泵，UV检测器(美国安捷伦仪器公司)；UV-2700紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；BT124S型电子天平(德国赛多利斯集团)；KQ-70VDB双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 绿袍散(西安顺康制药有限公司，规格：瓶质量1.5 g，批号：170704，170801，170802)；对照品：靛蓝(批号110716-200610，质量分数100%)，靛玉红(批号110717-200204，质量分数100%)，均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；磷酸，丙酮，氯仿和N，N-二甲基甲酰胺等均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Welch Ultimate XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1 mL·L-1磷酸(73∶27)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：288 nm；进样量：5 μL，在上述色谱条件下测定对照品、供试品溶液及阴性样品溶液。理论塔板数以靛蓝峰计算不低于14 500，分离度>1.5，色谱图见图1。

2.2对照品溶液的制备 精密称取靛蓝对照品4.91 mg，置于25 mL量瓶中，加DMF超声溶解后稀释至刻度；精密称取靛玉红2.52 mg，置于250 mL量瓶中，加DMF超声溶解后稀释至刻度，作为对照品储备液。分别精密吸取上述靛蓝和靛玉红储备液5 和0.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，作为对照品溶液(靛蓝和靛玉红质量浓度分别为98.20和2.52 μg·mL-1)。

2.3供试品溶液的制备 精密称取绿袍散样品(批号170704)0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺溶液25 mL，密塞，称定质量，超声处理10 min，放冷，再称定质量，用N，N-二甲基甲酰胺补足减失的质量，摇匀，用微孔滤膜0.45 μm滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4阴性样品溶液的制备 按照绿袍散处方工艺和处方量的1/10制备缺青黛药材的阴性样品，按照2.3项下供试品溶液的制备方法，同法制成阴性样品溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液以及阴性样品溶液各5 μL，按照2.1项下色谱条件进样，见图1，结果发现，青黛药材的阴性样品对靛蓝和靛玉红的测定无干扰。

图1HPLC图

A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.靛蓝；2.靛玉红。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.indigotin；2.indirubin.

2.5线性关系的考察 分别精密吸取2.2项下制备的对照品溶液1，2，5，10，15和20 μL，注入液相色谱仪，按照2.1项下色谱条件进行测定，以进样的质量(ng)为横坐标(x)、相对应的峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，结果靛蓝质量在98.20～196.40 ng范围内线性关系良好，线性方程为y=1.960 5x+44.359 0，相关系数r=0.999 4；靛玉红质量在2.52～50.40 ng范围内线性关系良好，线性方程为y=0.157 5x+0.537 1，相关系数r=1.000 0。

2.6精密度实验 取2.2项下制备的对照品溶液，按照2.1项下色谱条件分别进样1，10和20 μL，各6次，进行测定，结果表明，对照品溶液中靛蓝和靛玉红峰面积的RSD值分别为0.46%和1.19%，均在2%之内，结果表明，该方法精密度良好。

2.7稳定性实验 取2.3项下制备的供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别在0，1，2，4，8，12和24 h测定，进样量为5 μL，连续考察24 h，记录色谱峰峰面积，结果靛蓝和靛玉红峰面积的RSD值分别为1.39%和2.36%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8重复性实验 取绿袍散样品(批号170704)，按照2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，计算6份样品中靛蓝和靛玉红的RSD值分别为0.73%和1.24%，结果表明，供试品溶液稳定，该方法重复性良好。

2.9加样回收率实验 精密称取已知含量的绿袍散样品(批号170704)6份，每份0.1 g，另精密称取靛蓝对照品16.86 mg，置于25 mL量瓶中，作为对照品溶液，分别往上述6份样品中各精密加入上述靛蓝对照品溶液3 mL，靛玉红储备液1 mL，按照2.3项下方法进行制备，按照2.1项下色谱条件进行测定，分别计算靛蓝和靛玉红的回收率，结果见表1。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 Results of the recovery test(n=6)

成分取样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%靛蓝0.102 32.174 42.023 24.100 5 95.294.81.40.101 62.159 62.023 24.095 8 95.70.103 92.208 42.023 24.092 0 93.10.101 82.163 82.023 24.118 2 96.60.100 82.142 62.023 24.042 4 93.90.102 62.180 82.023 24.086 7 94.2靛玉红0.102 30.057 70.056 50.108 7 90.290.01.10.101 60.057 40.056 50.108 0 89.60.103 90.058 70.056 50.108 9 88.90.101 80.057 50.056 50.107 9 89.20.100 80.056 90.056 50.108 5 91.40.102 60.057 90.056 50.109 1 90.7

2.10样品含量测定 分别取不同批号的绿袍散样品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，每批样品平行制备2份，按照2.1项下色谱条件进行测定，采用外标一点法分别计算3批样品中靛蓝和靛玉红的含量，结果(批号170704、170801和170802样品中靛蓝和靛玉红的含量分别为21.255 5和0.564 5，20.907 8和0.558 8，21.073 9和0.565 0 mg·g-1。

3 结果与讨论

3.1溶剂的选择 《中国药典》中靛蓝的溶剂采用氯仿，靛玉红则是N，N-二甲基甲酰胺，由于氯仿对靛玉红的溶解性较差，实验比较了氯仿、甲醇、丙酮及N，N-二甲基甲酰胺分别作为提取溶剂对绿袍散中靛蓝和靛玉红含量测定的影响。结果显示，选用N，N-二甲基甲酰胺作为提取溶剂，绿袍散中靛蓝和靛玉红的含量最高，因此本实验选用N，N-二甲基甲酰胺作为供试品溶液的提取溶剂。

3.2测定波长的选择 实验采用紫外分光光度计对靛蓝、靛玉红和供试品溶液分别在400～260 nm之间进行全波长扫描，由光谱图可以看出靛蓝的最大吸收波长为423，333和288 nm，靛玉红的最大吸收波长为363和293 nm，供试品溶液的最大吸收波长为423，336和284 nm，实验分别在288和293 nm处进行测定，结果发现对靛蓝的含量测定影响较大，对靛玉红的含量影响不大，且靛蓝的最大紫外吸收与供试品溶液的最大吸收接近，由于样品中靛蓝的含量高，因此根据供试品溶液和对照品溶液的光谱图比较，并参考《中国药典》青黛药材项下对其含量测定的条件，确定实验检测波长为288 nm。

3.3耐受性考察 实验对供试品溶液测定中的不同波长、流速、柱温、色谱柱和流动性比例进行了考察，结果发现其对靛蓝和靛玉红的保留时间和分离度均有影响，对峰面积和含量测定结果均无显著性影响，因此需要对其波长、流速和柱温等进行控制，同时采用安捷伦1260、岛津LC-10A和赛默飞Ultimate3000不同型号的高效液相色谱仪进行测定，结果发现三者含量测定值的RSD<1%，差异无统计学意义，不影响测定结果。

3.4结果的判定 《中国药典》2015年版规定青黛药材中靛蓝不得少于2.0%，靛玉红不得少于0.13%，绿袍散处方中的青黛药材占27.74%，按照处方比例青黛中靛蓝的含量应不低于5.548 mg·g-1，靛玉红不低于0.361 mg·g-1，实验测定3批样品的结果中靛蓝和靛玉红含量分别为20.907 8～21.255 5和0.558 8～0.565 0 mg·g-1，均符合药典要求，因此本实验建立的方法可作为该散剂中青黛的质量控制方法，该方法操作简单、准确度高、专属性强，可为绿袍散的质量标准修订提供参考。