HPLC法测定芦丁和木犀草素的含量

李 鹏，王 鹏，王小宾，杨广德

(1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.咸阳市公安刑警支队药剂科，咸阳 712000)

木犀草素(luteolin)(见图1A)是一种天然四羟基黄酮类化合物，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及增敏抗癌药物活性等抗肿瘤作用，还具有抗氧化、抗炎、保护神经、抗病毒以及降血脂和胆固醇等作用，有广泛的应用价值和良好的开发前景[1-4]。目前，木犀草素的来源除了天然提取外[5-7]，还有全合成与半合成法获取[4]。采用芦丁(见图1B)为原料，能合成高收率和高含量的木犀草素[8-14]，该工艺原料易得、工艺简单、成本低。由于合成反应过程中，通常需要检测反应的进度以及合成物的质量分数，参考有关文献[15-20]，制定用HPLC法测定芦丁和木犀草素的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器 L-3000型高效液相色谱仪(北京普源精仪科技有限责任公司)；Germsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，西安武本生物科技有限公司)；CPA225D型十万分之一电子天平(沈阳神宇龙腾天平有限公司)；KQ5200B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；UV765型紫外分光光度计(上海仪分科学仪器有限公司)。

图1木犀草素和芦丁的结构式

A.木犀草素;B.芦丁。

Fig.1 Structural formula of rutin and luteolin

A.luteolin;B.rutin.

1.2试药 对照品：芦丁(批号10080-201409，质量分数91.9%)，木犀草素(批号10086-201503，质量分数98.37%)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯，美国(TEDIA)天地试剂公司)；水(重蒸水，实验室自制)；磷酸(分析纯，广州市锦旺化工有限公司)；乙醇(分析纯，南京化学试剂股份有限公司)；样品，实验室自制。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Germsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为1 mL·L-1磷酸，梯度洗脱：0～8 min：20%A，8～15 min：20%～40%A，15～24 min：40%A，24～25 min：40%～20%A，25～30 min：20%A；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为360 nm；进样量为10 μL；柱温：30 ℃。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液 分别精密称取芦丁和木犀草素对照品40.84和14.73 mg，置于同一50 mL量瓶中，加入体积分数为70%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。配制成芦丁和木犀草素质量浓度分别为750.64和289.80 mg·L-1的对照品溶液。

2.2.2样品溶液 分别精密称取同一批号的芦丁合成木犀草素样品16.83和17.95 mg，置于50 mL量瓶中，加入40 mL体积分数为70%的乙醇超声溶解，冷却至室温，用体积分数为70%的乙醇稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3系统适用性实验 分别吸取2.2项下制备的对照品溶液、空白溶剂以及样品溶液，按照2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录色谱图。结果表明，在此色谱条件下，芦丁和木犀草素的分离良好，分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，且理论塔板数不低于4 000，空白溶液不干扰测定。色谱图见图2。

图2HPLC图

A.对照品；B.样品；C.溶剂；1.芦丁；2.木犀草素。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance;B.sample;C.solvent;1.rutin;2.luteolin.

2.4线性关系考察 精密量取2.2.1项下制备的对照品溶液1，2，4，6和8 mL，分别置于10 mL量瓶中，加体积分数为70%的乙醇稀释至刻度，摇匀。连同对照品溶液各吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定。以对照品溶液的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，芦丁和木犀草素的回归方程分别为：y=15.145x-135.6，r=0.999 7和y=38.075x-45.44，r=0.999 9。实验结果表明，芦丁和木犀草素的质量浓度分别为75.06～750.64 和28.98～289.80 μg·mL-1，与峰面积呈良好的线性关系。

2.5精密度实验 取同一对照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，重复进样6次，芦丁和木犀草素的RSD值分别为0.46%和1.02%。结果表明，该方法精密度良好。

2.6重复性实验 取同一批号样品平行制备6份供试品溶液，依照2.2.2项下方法制备样品溶液，测定，采用外标法计算供试品含量。结果表明，芦丁和木犀草素的平均含量分别为21.68%和62.37%，RSD值分别为0.12%和 0.37%。

2.7稳定性实验 取同一供试品溶液，分别放置0，2，4，8，12和24 h后，分别进样10 μL，测定峰面积。芦丁和木犀草素的RSD值分别为1.14%和0.81%。

2.8加样回收实验 精密称取已知含量的同一供试品(芦丁和木犀草素含量分别为18.28%和 64.37%)9份，分别置于50 mL量瓶中，样品中加入不同量的芦丁和木犀草素对照品溶液，按照2.2.2项下方法制备样品溶液，分别进样10 μL，记录芦丁和木犀草素所对应的峰面积，计算回收率，芦丁和木犀草素的平均回收率分别为99.26%和98.88%，RSD值均小于2.0%。结果见表1。

表1加样回收实验结果

Tab.1 Results of recovery tests of rutin and luteolin

取样量/g样品含量/g芦丁木犀草素对照品加入量/g芦丁木犀草素测得量/g芦丁木犀草素回收率/%芦丁木犀草素平均回收率/%芦丁木犀草素RSD/%芦丁木犀草素0.237 70.043 50.153 00.065 10.029 00.108 20.181 299.4697.4299.2698.881.141.870.267 30.048 90.172 10.065 10.029 00.113 20.200 898.8299.160.254 90.046 60.164 10.065 10.029 00.110 30.192 697.9998.410.309 30.056 50.199 10.130 10.058 00.188 00.255 4101.0497.060.258 60.047 30.166 50.130 10.058 00.176 40.223 499.2698.210.284 70.052 00.183 30.130 10.058 00.183 20.242 1100.79101.470.306 20.056 00.197 10.225 20.086 90.277 60.280 998.4296.330.262 50.048 00.169 00.225 20.086 90.272 50.256 899.71101.040.280 00.051 20.180 20.225 20.086 90.271 50.267 997.85100.84

2.9样品测定结果 分别精密吸取2.2项下制备的对照品溶液和样品溶液各10 μL，依照2.1项下色谱条件进行测定，采用外标法分别计算芦丁和木犀草素的含量，结果芦丁和木犀草素的平均含量分别为18.45%和64.21%。

3 讨论

3.1流动相的选择 本实验分别考察了以甲醇2 mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-1 mL·L-1磷酸和甲醇-0.1 mL·L-1磷酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，乙腈和甲醇做有机相均能达到分离效果，但考虑到乙腈分离效果较理想，所以最终采用乙腈-1 mL·L-1磷酸，梯度洗脱为流动相，峰形最佳，此时所有组分的出峰时间均在 25 min 前，且分离度好。

3.2色谱柱的选择 选用Germsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Diamensil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱，按照2.1项下色谱条件分别进样测定，分离效果良好，选用Germsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，出峰时间早，故优先选择该色谱柱。

3.3检测波长的选择 取2.2.1项下制备的对照品溶液，按照紫外分光光度法[21]，在200～600 nm波长处进行扫描，在360 nm处，芦丁和木犀草素均有最大吸收，故选择两者的共同检测波长为360 nm。

3.4样品溶解溶剂的选择 分别称取相同质量的供试品5份，分别选用相同体积的甲醇、体积分数为50%的甲醇、乙醇、体积分数为70%的乙醇以及流动相溶解样品，观察样品的溶解情况，结果体积分数为70%的乙醇溶解样品的效果最好，样液清澈透明；甲醇、体积分数为50%的甲醇以及流动相对产品的溶解样液不够清澈，故选用体积分数为70%的乙醇作为样品溶解的溶剂。