梗阻性无精子症患者ICSI助孕前药物干预效果观察

何泳志，李大文，成俊萍，潘琪

(广西壮族自治区人民医院，南宁530021)

近年来梗阻性无精子症(OA)的发病率逐年升高。OA多为炎性梗阻，炎症反应致精子质量下降可能是其妊娠率低的原因之一。卵胞浆内单精子注射术(ICSI)是目前治疗OA的主要方法，但妊娠率仅为30%～50%[1]。目前国内大部分生殖中心对OA患者行ICSI助孕前不给予药物干预，药物干预对OA患者行ICSI治疗后妊娠结局的影响鲜见报道。脂质代谢参与精子与卵母细胞结合，并影响胚胎质量。左卡尼汀具有抗氧化作用，可调控脂质代谢，改善精子质量。本研究探讨OA患者ICSI助孕前给予左卡尼汀干预对妊娠结局影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1～11月我院收治的OA患者及其配偶136对，男方年龄(28.43±2.19)岁，睾酮(524.35±91.37)ng/dL，FSH(7.29±2.28)IU/L，睾丸体积(29.94±2.03)mL；女方生殖功能均良好，年龄(27.53±2.32)岁，获卵数(10.31±3.59)个，左侧窦卵泡数(7.25±1.29)个、右侧窦卵泡数(7.18±1.24)个。OA的诊断标准：经3次或3次以上精液常规检查并经过离心后确认，精子数均为0；FSH基本正常；睾丸活检中存在精子；睾丸体积>30 mL或单侧体积>15 mL。纳入标准：符合OA诊断标准；男性年龄20～40岁，女性年龄20～38岁；女方月经来潮2～4天查性激素及B超检查窦卵泡情况示卵巢功能正常；女方通过长方案超促排卵取出卵子>5个。排除标准：夫妇双方近期高热或有手术麻醉史；具有家族遗传病史或染色体异常；具有吸烟、酗酒或吸毒等不良嗜好；患有不宜生育的疾病。将研究对象随机分为干预组71对和对照组65对，两组男女双方基本资料均具有可比性。

1.2 治疗方法 干预组OA患者服用左卡尼汀口服液1.0 g，2次/d；对照组不给予任何药物。连续服药3个月结束时，在女方取卵当天所有OA患者均行经皮附睾精子抽吸术(PESA)取精、ICSI助孕。具体方法：①促排卵和采卵：两组女方均行控制性促排卵和采卵。促排卵采用常规促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案，即从前一个月经周期21日起皮下注射GnRH-a行降调节，当达到降调节的相关指标后，增用促性腺激素(Gn)诱导卵泡发育。如果有2个主导卵泡直径≥18 mm，停止使用GnRH-a和Gn，根据患者具体情况当晚肌注人绒毛膜促性腺激素(HCG)，给药36 h于手术室在阴道B超引导下行经阴道超声穿刺取卵。将获得的卵母细胞放在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4～6 h以备行ICSI。卵母细胞受精前于显微镜下观察其成熟情况，处在分裂中期Ⅱ(MⅡ)的卵细胞视为成熟卵细胞。②PESA：OA患者取仰卧位，常规消毒、铺巾。采用5 mL注射器吸入少量培养液，直视下用4号半针头经皮穿刺附睾，负压抽吸至有淡黄色浑浊液体抽出。如未见液体被抽出，可改变穿刺方向重复抽吸。将抽吸出的液体注入含精子洗涤液的培养皿，于倒置显微镜下寻找并取出活动的成熟精子。③ICSI：取MⅡ期的成熟卵细胞行单精子显微注射。注射后16～18 h观察受精情况，48 h观察卵裂情况，48～72 h选取优质胚胎由生殖医生行胚胎移植。

1.3 相关指标观察

1.3.1 精子DNA断裂率(DFI)、顶体完整率及自发顶体反应率 分别于治疗前及给药3个月结束、女方取卵当天对OA患者行睾丸活检并取出精子，检测精子DNA完整率、精子顶体完整率及精子自发顶体反应率。精子DFI检测：采用精子染色质扩散试验。将获得的精子接种于4孔皿，接种密度为5×105个/mL。随机计数400个精子观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4个等级，大和中光晕表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。判断标准：精子头直径≤1/4为小光晕，1/4<精子头直径≤2/3为中光晕，精子头直径>2/3为大光晕。以精子DFI表示精子DNA完整率。精子顶体完整率及精子自发顶体反应率检测：将获得的精子置于450～490 nm激发光下于400倍油镜下观察，判断精子顶体完整性。判断标准：顶体完整：精子头部一半以上荧光染色明亮且均匀；顶体反应：精子仅在赤道带出现荧光带，或者在顶体区根本没有荧光染色；顶体异常：除上述两类精子外的所有其他精子。随机计数200个精子，计算精子顶体完整率及精子自发顶体反应率。

1.3.2 受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率 行ICSI后第1天观察卵子受精情况，以双原核(2PN)卵子作为正常受精卵。行ICSI第3天遵循Peter分级原则选择优质胚胎(Ⅰ级和Ⅱ级)或囊胚进行移植，胚胎移植的数量不超过3个，其他Ⅱ级以上胚胎经患者知情同意后冻存，剩余胚胎经患者同意后予以医学丢弃，在此过程中女方给予黄体酮支持。移植术后14天若女方血β-HCG为阳性，则在移植术后第35天进行B超观察宫腔内孕囊数目和胎心搏动以判断是否临床妊娠。统计女方受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率。受精率=正常受精数/获卵数×100%；卵裂率=正常卵裂胚胎数/正常受精卵数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/总胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠例数/总例数×100%。

2 结果

2.1 两组OA患者精子DFI、顶体完整率及自发顶体反应率比较 干预组治疗后精子DFI及自发顶体反应率均低于治疗前及对照组治疗后，精子顶体完整率均高于治疗前及对照组治疗后，组间及组内比较P均<0.01；对照组治疗前后三项指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 两组OA患者精子DFI、顶体完整率及自发顶体反应率比较

注：与同组治疗前比较，*P<0.01；与对照组治疗后比较，△P<0.01。

2.2 两组女方受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率比较 干预组共获得748个卵子，正常受精卵679个，正常卵裂胚胎672个，优质胚胎311个，临床妊娠33例；对照组共获得663个卵子，正常受精卵557个，正常卵裂胚胎550个，优质胚胎195个，临床妊娠23例。干预组受精率、优质胚胎率均高于对照组(P均<0.01)，两组卵裂率、临床妊娠率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 两组女方受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率比较(%)

注：与对照组比较，*P<0.01。

3 讨论

OA在生殖医学领域是造成难治性男性不育的原因之一。ICSI技术的成功应用使广大OA患者实现了生育愿望[4]。生殖系统炎症如阴囊炎、附睾炎、精囊炎、睾丸炎、前列腺炎等均可能导致精路梗阻，慢性附睾炎可导致附睾纤维化、功能丧失，长期梗阻淤积导致氧化应激损伤，抑制附睾内精子发育成熟；附睾内炎性物质、淤血及组织碎片等均会导致精子损伤。因此OA患者附睾精子质量较正常患者有所下降[5,6]。但OA患者附睾精子质量下降这种情况在人类辅助生殖过程中尚未引起生殖科医师的重视，目前大多数生殖中心对于OA患者行ICSI助孕前不予药物进行干预。

卡尼汀又称肉毒碱或肉碱，在人体内可以通过自身合成满足生理代谢的需求。卡尼汀有三种光学旋光体，即右旋D型、左旋L型及外消旋化DL型，惟有左旋L型卡尼汀即左卡尼汀具有生理活性。左卡尼汀可竞争性抑制肉碱脂肪酰转移酶(PTC)活性和肉碱乙酰转移酶(CAT)活性，阻碍人类细胞的脂肪代谢过程[7]，在卵母细胞成熟、精卵结合过程和胚胎培养过程中均发挥重要作用[7,8]。精子顶体质量是评价精子质量的常用指标[9]。评价精子顶体是否缺陷的主要指标包括精子顶体完整率及精子顶体酶水平。男性不育的重要原因之一就是精子顶体缺陷导致顶体不完整[10]。相关研究发现，精子顶体基质可以发挥支架作用，当精子发生顶体反应时可以释放及控制与精子顶体相关的蛋白质。精子顶体基质位于精子头部，可以和卵母细胞周围的透明带进行相互作用，当精子发生顶体反应时即使相关蛋白被水解，精子顶体还能继续保持稳定性。在受精过程中发生顶体反应是一个基本步骤，顶体膜和细胞质膜混合形成的囊泡在细胞外释放顶体酶，顶体酶覆在精子头部，并使精子穿透卵母细胞进行受精[11,12]。

本研究对OA患者在行ICSI助孕前应用左卡尼汀进行干预，3个月后采用PESA取出附睾精子行ICSI助孕，结果发现药物干预组OA患者精子DNA完整率与精子顶体完整率均高于对照组，精子顶体自发反应率显著低于对照组。提示左卡尼汀可能通过抗氧化应激作用改善精浆内环境，促进相关蛋白表达，有利于改善精子能动性；左卡尼汀应用于OA患者可以改善其附睾精子染色质的质量，提高精子DNA完整性。由于精子顶体不完整、顶体酶缺陷及精浆内存在氧化应激的环境导致精子在未受精前发生顶体反应，进而影响精子受精和精卵融合；左卡尼汀具有抗氧化应激等作用，可提高精子的顶体完整性，继而降低精子顶体自发反应[13]。本研究中干预组女方受精率与优质胚胎率优于对照组，提示左卡尼汀可能通过提高OA患者附睾精子的功能及质量包括精子能动性、精子DNA完整性及顶体完整性等提高受精率及优质胚胎率。

综上所述，OA患者行ICSI前给予药物辅助治疗可提高精子质量，改善临床妊娠结局。