慢病毒介导siRNA干扰CEP55表达对卵巢癌细胞生物学行为的影响

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(中山大学附属第八医院(深圳福田)妇产科,广东 深圳 518033)

卵巢癌的发病率仅次于乳腺癌和宫颈癌，死亡率占所有妇科恶性肿瘤死亡率之首，是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一[1]。卵巢位于盆腔内，位置深、发病隐匿，早期无明显症状，70%以上的患者发现时已进展为晚期[2]。手术根治和化疗是治疗卵巢癌的首选方法，但临床效果不尽人意，晚期患者5年生存率低至25%～30%[3]。所以探讨卵巢癌的发病机制对于其临床防治具有重要意义。中心体相关蛋白55(centrosomal protein of 55，CEP55)是卷曲螺旋蛋白家族成员之一，锚定微管聚合相关蛋白，参与纺锤体的形成，从而调控细胞周期[4-5]。研究显示，CEP55与胃癌[6]、乳腺癌[7]等多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。然而有关CEP55与卵巢癌生物学行为的关系，鲜有文献报道。本研究通过慢病毒介导siRNA干扰CEP55表达，观察其对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为的影响，从而为卵巢癌的临床防治提供一定的实验依据。

1　材料与方法

1.1实验材料卵巢癌SKOV3细胞株(中国科学院上海细胞库)；SPF级雄性BABL/c小鼠，6～8周龄(上海斯莱克实验动物中心，许可证号SCXK沪2012-0005)；RM-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司,美国)；CEP55 siRNA慢病毒载体(System Biosciences公司，美国)；逆转录PCR试剂盒(ABI Applied Biosystems公司，美国)；TRIzol法RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，美国)；兔抗人CEP55一抗、HRP标记的羊抗兔二抗、BAD显色试剂盒(Santa Cruz公司，美国)；噻唑蓝(Sigma公司，美国)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(罗氏公司，瑞士)；超净工作台、恒温CO2培养箱、酶标仪(Thermo Scientific公司，美国)；低温高速离心机、微量移液枪(Eppendorff公司，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)。

1.2实验方法SKOV3细胞株接种于RM-1640培养基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素)；置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，隔天换液，细胞融合至85%时，用0.25%的胰蛋白酶消化后传代。

1.3CEP55 siRNA慢病毒转染SKOV3细胞及稳定转染细胞株筛选取对数生长期的SKOV3细胞接种于6孔板，细胞长满至60%时，随机分为3组进行实验：(1)CEP55组：用CEP55 siRNA慢病毒(MOI=50)转染细胞，(2)阴性对照组：用不含CEP55 siRNA基因的慢病毒(MOI=50)转染细胞，(3)空白对照组：不处理，未用慢病毒转染。转染48h后计算转染效率=(荧光表达细胞数目/白光视野细胞总数)×100%。

取上述各组细胞接种于6孔板内，分批次加入0、1、2、3、4、5μg/mL的嘌呤霉素，14天内让所有细胞死亡的最低浓度嘌呤霉素即为最佳筛选浓度。再取上述各组细胞接种于6孔板，孵育24 h后加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素，隔天更换新的培养液(含最佳筛选浓度的嘌呤霉素)，连续培养10天，收集抗性细胞，获得稳定抑制CEP55表达的转染细胞株。

1.4RT-CR和Western blot检测CEP55表达(1)收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA，A260/A280比值1.8～2.0提示样品RNA满足实验要求，按逆转录试剂盒操作反转录成cDNA，进行PCR扩增分析，引物委托上海吉玛公司合成，PCR扩增产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，Bio-Rad扫描分析，目的基因表达量=目的基因光密度值/内参基因光密度值。(2)收集各组细胞总蛋白，80 μg总蛋白上样，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜。TBS-T漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗人CEP55一抗工作液(1∶500)，4 ℃孵育过夜。TBS-T漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗工作液(1∶500)，37 ℃孵育1 h。TBS-T漂洗，暗室内BAD显色、曝光，Bio-Rad扫描分析。目的蛋白表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.5噻唑蓝比色法检测SKOV3细胞增殖实验分组同1.3，细胞接种于96孔板，分别于12、24、36、48、72 h每孔加入20 μL噻唑蓝溶液(5 mg/μL)。4 h后甩干，每孔再加入二甲基亚砜150 μL，待结晶溶解后，酶标仪于570 nm处测定OD值，并绘制生长曲线。

1.6TUNEL法检测SKOV3细胞凋亡实验分组同1.3，细胞接种于放置盖玻片的6孔板，48 h后收集盖玻片，二甲苯浸洗2次，梯度酒精浸洗1次，磷酸盐缓冲液漂洗2次。加入Proteinase K工作液，37 ℃下孵育30 min。磷酸盐缓冲液漂洗2次，加入50 μL的TUNEL反应混合液，封膜，暗湿盒中37 ℃下孵育30 min。磷酸盐缓冲液漂洗3次，加50 μL的converter-POD工作液，封膜，暗湿盒中37 ℃下孵育30 min。磷酸盐缓冲液漂洗3次，加入100 μL的DAB显色剂，25 ℃下孵育10 min。磷酸盐缓冲液漂洗3次，苏木素，自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下进行细胞计数。

1.7Transwell实验检测SKOV3细胞侵袭实验分组同1.3，用不含血清的RM-1640培养液将细胞接种于Transwell小室上室，同时在Transwell小室下室中加入含10%胎牛血清的RM-1640培养液。孵育48 h后，用棉签擦去基底膜内侧细胞，基底膜外侧的细胞用4%中性甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数染色细胞数目。

1.8细胞划痕实验检测SKOV3细胞迁移实验分组同1.3，将细胞接种于6孔板，待融合至85%时，在6孔板底部划直线，用不含血清的RM-1640培养液继续孵育，48 h后弃去培养液，细胞经4%中性甲醛固定，Gimesa染色，细胞迁移能力=0 h划痕距离-48 h划痕距离。

2　结　　果

2.1细胞转染及稳定转染细胞株筛选转染48 h后，CEP55组和阴性对照组转染效率分别为(89.4±4.7)%和(87.5±4.3)%，并经最佳浓度的嘌呤霉素(4 μg/mL)筛选得到了稳定转染细胞株。见图1。

图1　荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况(100×)空白对照组未见绿色荧光蛋白，CEP55组和阴性对照组可见大量细胞表达绿色荧光蛋白，提示慢病毒转染成功

2.2各组细胞CEP55表达比较RT-CR和Western blot检测显示，CEP55组CEP55 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见表1和图2。

表1　RT-CR和Western blot检测CEP55表达

图2　Western blot检测CEP55蛋白表达

2.3干扰CEP55表达对SKOV3细胞增殖、凋亡的影响细胞生长曲线显示，第12、24、36、48、72 h时，CEP55组OD(570)值明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)；TUNEL检测显示，CEP55组细胞凋亡率(23.7±6.9)%显著大于阴性对照组(5.3±1.4)%和空白对照组(6.4±1.1)%，(P<0.05)。见图3、图4。

图3　噻唑蓝比色法检测干扰CEP55表达对SKOV3细胞增殖的影响与阴性对照组和空白对照组比较，*P<0.05

图4　TUNEL检测干扰CEP55表达对SKOV3细胞凋亡的影响(200×)A1～C1显示用DAPI 对细胞核染色，A2～C2显示用TUNEL染色的凋亡细胞

2.4干扰CEP55表达对SKOV3细胞侵袭、迁移的影响Transwell实验显示，CEP55组穿膜细胞数目(11.3±4.1)个，明显少于阴性对照组(33.8±7.3)和空白对照组(37.5±7.0)，(P<0.05)；细胞划痕实验显示，CEP55组细胞迁移距离(245.8±33.7)μm，明显小于阴性对照组(447.8±53.1)μm和空白对照组(453.6±55.2)μm，(P<0.05)。见图5、图6。

图5　Transwell实验检测干扰CEP55表达对SKOV3细胞侵袭能力的影响(100×)

图6　细胞划痕实验检测干扰CEP55表达对SKOV3细胞迁移能力的影响(100×)

3　讨　　论

中心体是一个非膜性细胞器，位于细胞核周围，作为细胞中首要的微管组织，在细胞生命活动中发挥着重要作用，中心体由中心粒和中心粒周围物质两部分组成[8]。CEP55是中心粒周围物质中的重要调节蛋白，参与微管聚集、纺锤体装配、极化、分离和胞质分裂，Fabbro等[9]学者研究发现沉默CEP55可导致多核细胞、中期纺锤体异常，细胞停滞于中间体阶段，胞质分裂失败。此外，CEP55还参与中心体功能的调节，其表达异常导致非整倍体细胞和不稳定染色体组的出现，而多种恶性肿瘤细胞中均存在非整倍体细胞和不稳定染色体组[10]。说明CEP55参与了多种恶性肿瘤的发生、发展。张勇等[11]研究发现，下调CEP55表达能够显著抑制肝癌HepG2和HeP3B细胞的增殖，阻滞细胞G2周期。于震男等[12]研究显示，CEP55在脑胶质瘤组织中的表达显著增加，而沉默CEP55表达可显著抑制胶质瘤LN229细胞的增殖、侵袭和迁移。然而有关CEP55与卵巢癌生物学行为的关系，鲜有文献报道。

RNA干扰技术是近年来广泛应用的调节基因表达的技术，已成为实现基因功能研究和基因治疗的重要手段[13-14]。制约RNA干扰技术广泛应用的关键在于如何将外源性siRNA完整送入靶细胞，实现靶基因沉默。质粒和病毒是目前常用的两组siRNA载体，其中质粒载体制备简单，然而导入效率不高，且很难实现长期稳定的表达。病毒载体主要包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，其中慢病毒具有导入效率高、免疫反应小等优点，能够将外源性siRNA高效整合至靶细胞，并实现长期稳定表达[15-16]。

本文采用了siRNA慢病毒载体，结果发现，CEP55 siRNA慢病毒转染效率为(89.4±4.7)%，CEP55组CEP55的mRNA和蛋白表达显著降低，说明CEP55 siRNA转染成功并有效抑制CEP55表达，此外通过嘌呤霉素筛选，获得了稳定抑制CEP55表达的细胞株。恶性肿瘤的特点之一就是细胞接触生长抑制性丧失，为了验证CEP55与肿瘤细胞异常增殖的关系，本研究观察了干扰CEP55表达对细胞增殖、凋亡的影响，结果发现，CEP55组第12、24、36、48、72 h时的OD(570)值显著降低，细胞凋亡率[(23.7±6.9)%]显著增加，说明干扰CEP55表达能够明显抑制细胞增殖，促进其凋亡。为了进一步验证CEP55与肿瘤细胞侵袭、转移的关系，本研究进一步观察了干扰CEP55表达对细胞侵袭、迁移能力的影响，结果发现，CEP55组穿膜细胞数目[(11.3±4.1)/个]明显减少，细胞迁移距离[(245.8±33.7) μm]明显减小，说明干扰CEP55表达抑制了肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。

综上所述，慢病毒介导siRNA干扰CEP55表达可显著抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、促进其凋亡、降低其侵袭和迁移能力。从而为卵巢癌的临床治疗提供了新的思路和靶点，但CEP55与卵巢癌发生、发展的具体作用机制尚需进一步研究。