活化素受体样激酶1与心血管疾病研究进展

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(1.中南大学湘雅药学院药理学系，湖南 长沙 410078；2.心血管研究湖南省重点实验室)

活化素受体样激酶1(activin receptor-like kinase 1，ALK1)是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)受体超家族的一种跨膜丝氨酸/苏氨酸受体激酶。ALK1具有显著的细胞特异性，主要表达于动脉内皮细胞(endothelial cells，ECs)[1]。ALK1与四个配体相互作用：(1)TGF-β1和TGF-β3，与TGF-β II型受体(TβRII)形成复合体；(2)骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)9和BMP10，与活化素受体IIA型(ActRIIA)或BMPII型受体(BMPRII)形成复合体。ALK1激活诱导Smad1/5/8磷酸化，Smad1/5/8与同类受体Smad4形成二聚物，此复合体转移至细胞核并直接调节特定基因的转录[2]。

ALK1编码基因Acvrl1杂合突变导致2型遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia，HHT2)的发生，而促进配体结合的辅助受体内皮糖蛋白(endoglin)杂合突变则引起HHT1[3-4]。这两个基因突变占HHT病例的85%～96%[5]。缺少ALK1信号传递会使HHT患者发展成动静脉畸形，其特征为动脉和静脉之间直接发生联系。由于正常的毛细血管起到缓冲动静脉之间血液流动速度，并与周围组织进行高效气体交换的作用，因此动静脉畸形可导致组织出血和缺氧。ALK1不仅在内皮细胞表达，也在平滑肌细胞、成肌纤维细胞、肝星状细胞、软骨细胞、单核细胞、成肌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞表达，但其在这些细胞中的作用还未得到深入研究[6]，这也说明ALK1与心血管疾病的确存在复杂的联系。本文旨在描述ALK1的信号传导和对心血管内稳态的病理生理作用及相关机制，从而概述其与心血管疾病的关系。

1　ALK1蛋白结构与基因调控

1.1ALK1结构ALK1 是TGFβ/BMP配体超家族的I型受体，结构可分为四大区域：①信号肽，在形成成熟蛋白质的过程中发生移动；②富含半胱氨酸的EC域，属于配体结合区域；③细胞内域，富含甘氨酸/丝氨酸GS域(172-201)和丝氨酸/苏氨酸激酶域(202-492)，对调节激酶活性很重要，可使Smad1/5/8磷酸化；④单独的跨膜域(图1)。ALK1与其他I型受体的GS域、丝氨酸-苏氨酸激酶域和C-端尾部具有高度相似性[7]，但细胞外域却不同。

图1　ALK1的分子结构示意图

1.2ALK1与基因调控ALK1不与TGF-β直接结合，而是与TGF-β、TβRII(TGFβ II型受体)形成一个高亲和力的异聚受体复合体[8]。TβRII结合配体和ALK1后，使ALK1近膜GS域磷酸化，GS域又激活TβRII丝氨酸/苏氨酸激酶活性[9]。此外，免疫亲和素FKBP12[10]和核受体肝X受体β(LXRβ)[11]等蛋白质也能结合ALK1，并下调其表达。

ALK1下游激活时，其下游靶标pSmad1/5/8以及ID1、ID2、ID3编码转录抑制蛋白；Smad6和Smad7编码抑制型Smads[12-13]。Endoglin也是ALK1的靶标[12-13]。细胞实验发现，Notch和ALK1刺激对Notch靶标(由RBPJ/NICD引起的，如HEY1和HEY2)的mRNA表达具有加强或协同效应[14-15],而刺激BMP9会使pSmad1/5/8与这些启动子结合[16]。然而，pSmad1/5/8、RBPJ和NICD如何影响这些基因启动子尚不清楚。BMP9/ALK1下游靶标Notch的诱导是否需要RBPJ或NICD，证据不一致[14-15,17]。

其他由ALK1调控的基因包括编码动脉标记蛋白的趋化因子受体(CXCR4)和在内皮细胞表达的促迁移因子DLL4(delta-like 4)，以及编码内皮缩血管肽的内皮素-1 (endothelin 1，EDN1)[18]。破坏斑马鱼的ALK1编码基因Acvrl1或BMP10/BMP10类似物将上调CXCR4a和DLL4的表达，下调动脉内皮细胞中EDN1的表达[19-20]。在培养的人内皮细胞中，BMP9/ALK1信号传递会抑制CXCR4而诱导EDN1[21]。然而，无论是EDN1缺失还是Notch激活都足以形成Acvrl1突变拟表型，而无论是CXCR4a缺失还是Notch抑制都能够挽救Acvrl1突变[19-20]。人内皮细胞中，BMP9/ALK1信号传递也诱导联接蛋白40(CX40，也称为GJA5)表达，此蛋白能编码缝隙连接的组成部分，Acvrl1和CX40在基因水平上能影响小鼠受伤引起的皮肤动静脉畸形发展[22]。TMEM100编码功能未知的小跨膜蛋白，在小鼠和培养内皮细胞中，BMP9/ALK1诱导其表达[23-24]。TMEM100在胚胎和出生后动物的内皮细胞中表达，其大量缺失则能模拟动物Acvrl1在胚胎、新生儿和成年阶段的缺失表型[24]。TMEM100由内质网应激诱导，位于细胞膜上[21]，说明它可能通过内膜系统与跨膜受体的伴侣作用有关。

2　ALK1信号传导

2.1ALK1与TGF-β/BMP9/10人类TGF-β家族包括33个分泌配体，在结构和种系基础上分为多个亚族，包括TGF-βs、活化素类、Nodal和BMPs。TGF-β家族配体与I型和II型跨膜受体(丝氨酸-苏氨酸激酶)的胞外域结合。在I型受体的负调节域内，持续活化的II受体使保守的丝氨酸磷酸化[21]。活化的I型受体反过来磷酸化下游信号分子，即受体调节的Smads或R-Smads，将信号从细胞膜传递至细胞核[21]。人类和其他高等脊椎动物中存在7个I型(ALK1-7)和5个II型受体(ActRIIA、ActRIIB、BMPRII、TβRII、AMHRII)。I型受体ALK1、ALK2、ALK3和ALK6主要与BMPs和生长分化因子结合，并激活R-Smads 1、5、8，而ALK4、ALK5、ALK7与活化素类、肌肉生长抑制素和TGF-βs等配体结合，并激活R-Smads 2和3。活化的R-Smads与其共同伙伴Smad4形成一个复合物，并转移至细胞核内，在核内调节靶基因的转录[21]。

ALK1最初被描述为TGF-β受体，因为TGF-β1和TGF-β3能激活ALK1胞外域(ECD)/ALK5胞内域(ICD)嵌合受体[21]；同时，TGF-β1可以增强内皮细胞中ALK1/ALK5复合体的形成，并激活ALK1介导的Smad1/5/8磷酸化[21]。然而，TGF-β作为ALK1配体，在体内的生理意义还不清楚。最近发现，BMP9和BMP10是ALK1生理相关的配体。BMP9和BMP10生长因子域同源二聚体是TGF-β家族唯一与ALK1高度结合的配体[25]。

2.2ALK1与ALK5Smads 1和5信号传导由ALK1磷酸化诱导，与Smad2/3产生对抗作用。内皮细胞中ALK1过表达可减少ALK5的信号传递，然而内皮细胞中ALK5过表达却增加ALK1信号传递[26]。研究发现，TGF-β激活ALK5-Smad2/3和ALK1-Smad1/5/8通路，从而分别抑制与激活内皮细胞的迁移和增殖。然而，ALK1和ALK5的表达方式不同，预示它们具有独立的信号传递通路[26]。

2.3ALK1与内皮糖蛋白III型受体endoglin是TGF-β家族多个配体的辅助受体，所有配体中endoglin可以分别与BMP9和BMP10生长因子同源二聚体结合[21]。结构研究表明，在没有endoglin时，II型受体从BMP9或BMP10生长因子的功能前区取代它们，反之，与I型受体ALK1结合，形成信号复合体。当endoglin存在时，能促进BMP9与ALK1结合并增强信号传递；endoglin结合循环的BMP9或BMP10前复合体，从功能前区取代生长因子同源二聚体。这种由endoglin调控的对BMP9或BMP10同源二聚体在膜上的定位能促进ALK1的结合；最后，II型受体结合并取代endoglin，形成I型-II型受体信号复合体。然而，II型受体是如何取代endoglin以及膜粘附是如何影响这个过程的都还未知。

3　ALK1与心血管内稳态

内皮细胞和平滑肌细胞之间的关系成为血管内稳态的关键。血管内皮的主要作用是分泌一些物质，如血管舒张剂(NO、EDHF、PGE2)和血管收缩剂(TBXA2、内皮素)，从而促进平滑肌细胞收缩或舒张[27]。

3.1ALK1与内皮细胞ALK1表达增加可促进内皮细胞的增殖和迁移[26]。ALK1胞外域的嵌合蛋白能减少血管形成和限制肿瘤体积，作为有效的抗血管再生复合物，能减少新血管形成[28]。Endoglin+/-小鼠心肌梗死后血管再生受损，发现endoglin缺乏会下调TGF-β/ALK1信号通路，抑制内皮细胞增殖[29]。相反，也有文献报道，活化的ALK1，通过Smad1/5磷酸化，抑制人皮肤微血管内皮细胞和其他组织内皮细胞的增殖、迁移和粘附，对血管再生的成熟阶段产生影响[30]；ALK1基因剂量的减少(杂合ALK1+/-小鼠)导致视网膜血管内皮细胞增殖和血管增生增强[31]。ALK1与血管再生的关联存在相反的实验证据，可能与不同实验时使用的细胞类型和环境不同有关。

研究发现，BMP9/ALK1可阻止PI3K/AKT和VEGF引起的ERK激活。相反，药物抑制PI3K足以消除体内ALK1诱导的血管增生。PTEN是可以抵消内皮细胞PI3K信号通路的主要脂质蛋白磷酸酶。研究还发现，BMP9/ALK1通过刺激PTEN活性抑制PI3K信号级联[32]。而这并非BMP9/ALK1独有，因为之前研究已经证明DLL4/Notch也会诱导PTEN表达而抑制柄细胞增殖[33]。 考虑到先前ALK1和Notch之间的相互作用，BMP9刺激引起PTEN增加可解释为Notch引起的间接反应。然而，不能排除BMP9刺激时Smad对PTEN启动子的直接影响。事实上，VEGF通过增加内皮细胞中miR-17-92基因簇的聚集抑制PTEN表达[34]。因此，也可能是BMP9/ALK1通过抑制PTEN表达的负向调节因子来调控PTEN量。研究确定内皮细胞中BMP9/ALK1和PTEN之间的相互作用，对阐明ALK1表达缺失致血管增生的发病机制至关重要。

另有研究发现，Dkk-3(一种肿瘤抑制因子)通过激活ALK1受体而使Smad1,5,8磷酸化，诱导Smad4聚集在VEGF启动子上，上调VEGF转录水平而作用于内皮细胞，反过来，通过活化VEGFR2调控血管再生活性[35]。此外，TGF-β中和实验证明Dkk-3介导的ALK1受体活化不需要Dkk-3和TGF-β 相互作用。此外，内皮细胞中Dkk-3介导的ALK1激活和VEGF上调不需要TGF-β 。因此，Dkk-3是否为TGF-β 受体的直接激活因子，或其是否作用于另一种激活ALK1的膜受体仍然有待确定。Dkk-3与ALK1在内皮细胞中的功能联系提示Dkk-3在血管病理中发挥一定的作用。在病理条件下，Dkk-3可能通过增强Smad1，Smad5和Smad8磷酸化促进血管重构。

3.2ALK1与平滑肌细胞ALK1虽然主要在内皮细胞表达，然而ALK1对血管内稳态的调节作用并非全由内皮介导。ALK1也调节平滑肌细胞的分化和聚集[36]。ALK1也诱导血管间质细胞(vascular mesenchymal cells，VMCs)中基质Gla蛋白的表达[26]，促进VMCs增殖和分化。ALK1过表达能诱导ALK5的表达，从而上调α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。在人主动脉平滑肌细胞中，TGF-β通过Smad2/3和Smad1/5通路诱导平滑肌细胞分化(其标记因子为α-SMA和钙调节蛋白)，ALK1不参与这一过程而ALK5参与[37]，这表明TGF-β1可能激活Smad1/5，此时该通路与ALK1无关。因此，ALK1在平滑肌细胞分化中的作用有待深入研究。

4　ALK1与心血管疾病

4.1ALK1与肺动脉高压HHT与血管扩张、动静脉畸形、血管阻力低及可能的左心衰有关。相比之下，肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)的特点是肺动脉毛细血管增殖、血管收缩增强，从而导致阻力高、心排血量低及右心衰[38]。编码BMPR2和ALK1的基因突变与PH有关[26]。文献报道，Acvrl1胚胎体细胞镶嵌体的特点是两个不同的突变等位基因来自相同的单体型，因此能够解释HHT与PH的相关性；在外显子10内发现了两个相邻的致病杂合突变，突变在细胞隔离前发生，进而导致体细胞和生殖系组织基因镶嵌。相较于携带BMPR2突变体的PH患者，携带Acvrl1突变体的PH患者早期预后较差[39]。然而，矛盾的是，很少有患者出现HHT/PH综合征[40]。从遗传的角度来看，这种关系存在一定的意义，BMPR2编码可以与ALK1结合的II型受体，BMPR2杂合突变占70%以上的遗传性PH，20%的Acvrl1突变与PH发生有关。在极少数情况下，Acvrl1突变导致先天性PH或不患HHT的遗传性PH[41]。出现HHT/PH的患者大多存在Acvrl1基因杂合突变，而较少的患者存在BMPR2突变[21]。

PH时EDN1表达上调。EDN1是强有力的血管收缩剂和促细胞分裂剂，可调节内皮细胞迁移和血管再生[42]。研究发现，TGF-β通过ALK5/Smad3通路诱导EDN1表达，TGF-β抗迁移和抗增殖作用是由EDN1对内皮细胞的自分泌功能来调控的[43]。此外，BMP9以与TGF-β1相同的方式增加人肺微血管内皮细胞的EDN1产生，但当两者在一起，会进一步增加EDN1水平[44]。BMP9不仅通过ALK1受体诱导Smad1/5磷酸化，与TGF-β一样，也诱导Smad2的磷酸化。也有研究发现，BMP9可刺激人肺动脉内皮细胞中EDN1的释放，由Smad1和p38 MAPK介导，与Smad4途径无关；EDN1释放部分通过BMPRII和ALK1调节[45]。BMPRII功能障碍对EDN1基础水平的调节非常重要，因此对PH的发病机制也同样重要。

最近研究发现，抗小鼠ALK1胞外域的抗体(anti-mALK1)与ALK1细胞外区域结合，抑制小鼠肺动脉平滑肌细胞中TGFβ介导的Smad1/5磷酸化和核定位，说明ALK1调控小鼠肺动脉平滑肌细胞中TGFβ引起的Smad1/5磷酸化，这与之前在人主动脉平滑肌细胞的观察结果相反[46]。

4.2ALK1与动脉粥样硬化小鼠体内研究发现，ALK1在动脉弯曲和分支点的表达较强，而这些部位是易发生动脉粥样硬化的扰流位点[47]。另有研究表明，ALK1在内皮、新生内膜和人冠状动脉粥样硬化病变的血管中层表达增加[48]。有趣的是，也有研究发现ALK1细胞外域的顶端可以相对低的亲和力与含有ApoB100的循环低密度脂蛋白(LDL)结合，同时还能调控LDL转胞吞至内皮下的作用，从而启动动脉粥样硬化病变[45]。此作用不需要BMP9/BMP10、endoglin、BMPRII和ALK1激酶活性，以LDL/ALK1间的相互作用为目标可能发现防治动脉粥样硬化新靶点。

研究表明，抑制BMP信号传递可减少动脉粥样硬化斑块的形成。由于ALK1调节LDL吸收是通过在胞外直接与之结合，同时还传递BMP信号，所以ALK1在动脉粥样硬化的发展中至少发挥两个独立的功能。由于ALK1基因敲除会使早期胚胎血管缺陷及引起内皮细胞死亡，所以关于ALK1缺失是否影响体内LDL消除和动脉粥样化形成仍有待深入研究[49]。

4.3ALK1与高血压高血压和ALK1配体TGF-β之间存在密切关系。TGF-β1应急调控可诱导血管舒张并降低血压[50]。然而，TGF-β1表达增加与血压升高有关，TGFβ中和抗体可降低高血压大鼠血压[51]。血管紧张素II (angiotension II，Ang II)和醛固酮是血压的重要调控者，可增加TGF-β1的mRNA表达并使其转化为活性形式；Ang II也增加TGF-βII型受体mRNA的表达[52]。不仅ALK1的配体TGF-β1，ALK1本身也与高血压具有密切联系。ALK1受体与血压的调控有关，ALK1+/-小鼠的血压增高，主要是因为交感神经和肾素-血管紧张素系统的的激活以及胆碱能神经元的数量减少有关[53]。

4.4ALK1与心力衰竭心脏纤维化使心衰患者心肌僵硬，由于肌细胞分离使心肌收缩紊乱，阻断离子通道，加重组织缺氧。控制心脏纤维化最有效的促纤维细胞因子是转化生长因子β(TGF-β)家族。TGF-β1主要通过TGF-β II型受体(TGFβR2)、TGF-β I型受体(活化素受体样激酶5，ALK5) 和Smad2/3传递信号，促进心肌I型胶原蛋白的产生和心肌纤维化。研究表明，TGFβ-1/ALK5在成纤维细胞中传递信号需要TGF-β共受体endoglin，并且降低endoglin水平能通过减弱Smad2/3的信号传递从而抑制心肌纤维化[54]。研究表明，心衰患者和压力负荷小鼠模型的ALK1水平降低会进一步引起心衰，ALK1表达降低与心脏功能受损和心脏纤维化加重相关，此外，ALK1可能通过维持心衰中的Smad1活性来抑制心肌纤维化[55]。最近研究发现，ALK2在心肌细胞中表达并调控钙调磷酸酶激活，特异性敲除心肌细胞ALK2会减少血管紧张素II引起的小鼠心肌肥大和心脏纤维化，特异性敲除心肌细胞的ALK1则无表型影响[56]。这些发现提示，ALK1可能是心肌纤维化的一个重要负调控因子，ALK1在非肌细胞的表达可能对心脏重构至关重要。

敲除小鼠全身ALK1导致早期死亡和高输出性心力衰竭，这是由于动静脉畸形的发展及与内脏出血有关。在HHT2表型小鼠模型中的研究证明了充血性心力衰竭是适应性而非不适性重构，因为是高输出性心力衰竭[57]。近来ALK1抑制剂已经开发用于癌症治疗。不适性心脏重构常与化疗有关，临床研究发现出现收缩期心力衰竭的患者接受ALK1抑制剂治疗时必须排除高输出性心力衰竭。高输出性心力衰竭是HHT2患者最常见的死亡率增加的并发症[58]。

5　结论与展望

最初Acvrl1和endoglin是作为HHT的致病基因而发现。现在发现，ALK1对心血管内稳态的影响不仅是由于其对内皮细胞生物学的重要作用，ALK1也调节血管平滑肌细胞生物学。ALK1在炎症细胞、心肌细胞、成纤维细胞中也发挥作用，最近报道了第一个选择性的ALK1抑制剂San78-130，通过抑制ALK抑制肌成纤维细胞BMP-9/Smad1/5信号通路，也可促进离体血管新生[59]，说明其可能与其他重要的心血管疾病也存在联系，可能是心血管疾病的新靶点。