黄酮苯并咪唑衍生物的合成及体外抗肿瘤活性研究

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(南华大学药物药理研究所，湖南省分子靶标新药研究协同创新中心，湖南 衡阳 421001)

黄酮是一类天然产物，广泛存在于自然界中，表现出广泛的生物学活性。在过去数十年中，大量天然、半合成和全合成的黄酮类化合物已被开发用于各种疾病的治疗，如抗肿瘤[1]，抗炎[2]，抗菌[3]，抗氧化[4]等。

苯三甲氧基在抗肿瘤药物的设计中具有较高的研究价值，特别是在血管阻断剂的设计中。目前处于临床研究的血管阻断剂候选药物中，CA4P[5]及其类似物OXi4503[6]和AVE8062[7]，以及秋水仙碱类似物ZD6126[8],BNC105[9]和CKD-516[10](图1)结构中均含苯三甲氧基基团。

此外，苯并咪唑类化合物也已被广泛用于抗肿瘤药物的设计和开发。苯并咪唑及其衍生物通过抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖，介导肿瘤细胞凋亡或抑制缺氧诱导因子的表达[11]。因此，在本文中，苯三甲氧基在黄酮B环上进行结构修饰，再与苯并咪唑类化合物衍生化得到9个全新的3′4′5-三甲氧基-7-羟基黄酮苯并咪唑衍生物，并初步评价其体外抗肿瘤活性。

图1　CA4P，OXi4503，AVE8062，ZD6126，BNC-105和CKD-516的结构

1　材料与方法

1.1主要试剂间苯二酚(98%)、3,4,5-三甲氧基苯甲醛(98%)、氯乙腈(98%)、1，2-二溴乙烷(98%)、1，3-二溴丙烷(98%)、1,4-二溴丁烷(98%)、2-甲基苯并咪唑(98%)、2-氯苯并咪唑、(98%)、2-三氟甲基苯并咪唑(98%)购于阿拉丁试剂；胎牛血清FBS、RPMI-1640 培养基、DMEM培养基(Gibco 公司)；柱层析硅胶板(安徽跃化硅材料有限公司)；其他试剂均为市售分析纯。

1.2主要仪器Thermo Scientific Electrothermal Digital熔点测定仪(美国Thermo公司)，Bruker AV-400型光谱仪(美国Bruker公司)，Waters GCT质谱仪(英国Waters公司)，WellscanMK-2酶标仪(芬兰Labsystems公司)。

1.3方法

1.3.1化学合成目标化合物4-12采用的合成路线如图2所示。3′4′5-三甲氧基-7-羟基黄酮(2)的合成：将间苯二酚(2.5 g,0.023 mol)置于100 mL的三颈瓶中，加入无水乙醚30 mL，冰浴冷却，原料溶解完全后加入氯乙腈(2 mL,0.032 mol)与催化量的无水氯化锌，充分混匀，通入干燥氯化氢，3 h后将反应瓶4 ℃放置1 天，再通氯化氢2 h，4 ℃放置1 天，过滤，无水乙醚洗涤橘黄色沉淀，适量热水将洗涤后的橘黄色沉淀溶解于圆底烧瓶中，水浴加热回流1 h，4 ℃静置过夜，抽滤，即得到化合物2′-羟基-2-氯苯乙酮(1)。将化合物1 (2.2 g,0.012 mol)与3,4,5-三甲氧基苯甲醛(2.0 g,0.01 mol)混合，加入20 mL 95%乙醇溶解，摇匀，慢慢加入10 mL 10% NaOH，室温下搅拌2 天，用10% HCl调节pH至有黄色沉淀析出，抽滤，沉淀用无水乙醇溶解，缓慢滴加蒸馏水直至有结晶出现，静置过滤即得到化合物3′4′5-三甲氧基-7-羟基黄酮(2)。7-(2-溴乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3a)的合成：在250 mL圆底烧瓶依次加入化合物2(0.1 mol)、1，2- 二溴乙烷(0.4 mol)和少量的无水碳酸钾，丙酮溶液中(100mL)回流9 h(反应用薄层色谱法监测)。反应完全后减压蒸干丙酮，通过硅胶柱分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(100∶1)。化合物7-(3-溴丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3b)和7-(4-溴丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(3c)的合成：与化合物2a合成方法类似。7-(2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(4)：在100 mL圆底烧瓶依次加入化合物2a(0.01 mol)、2-甲基苯并咪唑(0.02 mol)和碳酸钾(0.02 mol)，溶解于30 mL丙酮，加热回流约12 h。反应完全后减压蒸干丙酮，通过硅胶柱分离纯化，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(150∶1)。化合物5-12的合成：与化合物4合成方法类似。

图2　黄酮苯并咪唑衍生物4-12的合成路线

1.3.2体外抗肿瘤活性评价采用MTT法研究化合物4-12对胃癌细胞MGC-803、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2的体外抗增殖活性，以5-氟尿嘧啶作为阳性对照。胃癌细胞MGC-803培养在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2培养在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。细胞均在37 ℃，5% CO2的培养箱中培育。取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，接种密度为8×103/孔，24 h后用不同浓度(256，128，64，32，16，8，4，2 μmol/L)的化合物进行了处理。48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。4 h后，每个孔加入150 μL的DMSO溶解晶体，并在490 nm处测量吸光度。50%细胞的抑制浓度(IC50)是由Logit法测定的。所有实验均操作三次。

2　结　　果

2.1目标化合物的表征7-(2-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(4)：橘黄色粉末,产率: 53%，Mp:192-193℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.71-7.67(m,1H),7.66(s,1H),7.37-7.32(m,1H),7.27-7.25(m,2H),7.10(s,1H),6.73(s,1H),6.68(d,J=2.0 Hz,1H),6.66(d,J=2.1 Hz,1H),6.60(d,J=2.0 Hz,1H),4.59(t,J=5.3 Hz,2H),4.39(t,J=5.2 Hz,2H),3.92(t,J=8.8 Hz,9H),2.72(s,3H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.69(s),167.90(s),165.30(s),153.28(s),152.04(s),147.09(s),142.65(s),139.89(s),134.82(s),127.63(s),126.01(s),122.38(s),122.30(s),119.36(s),115.55(s),112.63(s),111.98(s),108.83(s),108.75(s),97.29(s),66.71(s),61.02(s),56.22(s),42.97(s),14.11(s). MS(ESI):486.1(C28H26N2O6,[M+H+])。

7-(2-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(5)：黄色粉末,产率: 78%，Mp:153-156℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.70(d,J=7.1 Hz,1H),7.66(d,J=8.5 Hz,1H),7.44(d,J=7.4 Hz,1H),7.37-7.26(m,2H),7.11(s,1H),6.73(s,1H),6.68(d,J=2.1 Hz,1H),6.66(d,J=2.1 Hz,1H),6.63(d,J=2.0 Hz,1H),4.66(t,J=5.4 Hz,2H),4.41(dd,J=10.6,5.1 Hz,2H),3.92(t,J=8.7 Hz,9H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.69(s),167.92(s),165.23(s),153.31(s),147.11(s),141.74(s),140.49(s),140.14-139.67(m),135.28(s),127.65(s),126.03(s),123.52(s),123.09(s),119.73(s),115.62(s),112.60(s),112.06(s),109.55(s),108.77(s),97.34(s),66.46(s),61.03(s),56.24(s),43.51(s). MS(ESI):507.1(C27H23ClN2O6,[M+H+])。

7-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(6)：黄色粉末，产率: 77%,Mp:207-208℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.91(d,J=8.0 Hz,1H),7.67(t,J=8.3 Hz,2H),7.51(t,J=7.5 Hz,1H),7.42(t,J=7.6 Hz,1H),7.12(s,2H),6.74(s,1H),6.71-6.58(m,2H),4.82(s,2H),4.47(s,2H),3.94(t,J=8.2 Hz,9H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.70(s),167.93(s),165.11(s),153.32(s),147.08(s),141.08(s),139.97(s),135.82(s),127.62(s),126.04(s),125.71(s),124.07(s),121.84(s),115.66(s),112.69(s),112.11(s),110.89(s),108.81(s),97.20(s),66.95(s),61.03(s),56.25(s),44.08(s). MS(ESI):540.1(C28H23F3N2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4--酮(7)：黄色粉末,产率: 57%，Mp:169-171℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.62(t,J=8.8 Hz,2H),7.19(t,J=12.3 Hz,2H),7.11(td,J=14.2,6.7 Hz,3H),6.67(d,J=11.4 Hz,2H),6.56(s,1H),4.30(t,J=6.3 Hz,2H),3.90(dd,J=12.8,7.5 Hz,2H),3.83(d,J=3.5 Hz,9H),2.44(d,J=42.5 Hz,2H),2.28(dd,J=11.8,5.7 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.74(s),168.14(s),165.86(s),153.29(s),151.52(s),147.19(s),142.44(s),139.89(s),134.88(s),127.69(s),126.02(s),122.32(s),122.15(s),119.12(s),115.32(s),112.50(s),112.32(s),109.01(s),108.76(s),97.19(s),64.76(s),61.00(s),56.21(s),40.07(s),28.84(s). MS(ESI):500.1(C29H28N2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(8)：黄色粉末,产率: 66%，Mp:140-142℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.72(t,J=7.8 Hz,1H),7.56(s,1H),7.37-7.29(m,2H),7.14(s,2H),7.07(s,1H),6.76(d,J=6.8 Hz,1H),6.65(s,1H),4.49(t,J=5.7 Hz,2H),4.09(d,J=20.6 Hz,2H),3.93(d,J=6.5 Hz,9H),2.40(s,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.89(s),168.18(s),165.98(s),153.31(s),147.24(s),141.59(s),140.51(s),139.87(s),135.03(s),128.92(s),127.73(s),126.04(s),123.52(s),123.10(s),123.03(s),119.53(s),115.29(s),112.59(s),112.36(s),109.27(s),108.77(s),97.22(s),64.90(s),61.05(s),56.25(s),41.00(s),29.28(s),28.76(s). MS(ESI):521.1(C28H25ClN2O6,[M+H+])。

7-(3-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(9)：黄色粉末,产率: 72%，Mp:175-178℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.91(d,J=6.4 Hz,1H),7.75(d,J=8.4 Hz,1H),7.40(dd,J=15.9,8.3 Hz,3H),7.15(s,2H),6.78(d,J=6.8 Hz,2H),6.68(s,1H),4.62(t,J=6.8 Hz,2H),4.14(s,2H),3.95(t,J=10.9 Hz,9H),2.45(d,J=5.6 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.89(s),168.17(s),165.94(s),153.31(s),147.23(s),141.00(s),139.88(s),135.45(s),127.72(s),126.03(s),125.69(s),123.99(s),123.64(s),121.72(s),115.32(s),112.64(s),112.31(s),110.30(s),108.78(s),97.22(s),65.17(s),61.04(s),56.21(s),41.80(s),29.57(s). MS(ESI):554.1(C29H25F3N2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(10)：黄色粉末,产率: 61%，Mp:160-163℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.71(d,J=8.2 Hz,2H),7.31(s,1H),7.25(d,J=3.2 Hz,2H),7.15(s,2H),6.77-6.65(m,3H),4.23(t,J=6.9 Hz,2H),4.10(dd,J=14.1,8.6 Hz,2H),3.94(t,J=10.4 Hz,9H),2.64(s,3H),2.15-1.99(m,2H),1.89(d,J=6.3 Hz,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.77(s),168.20(s),166.39(s),153.32(s),151.32(s),147.29(s),142.71(s),135.06(s),127.78(s),125.95(s),122.10(s),121.93(s),119.23(s),115.07(s),112.27(s),112.20(s),109.04(s),108.76(s),97.21(s),68.17(s),61.04(s),56.25(s),43.49(s),26.60(s),26.45(s),14.05(s). MS(ESI):514.1(C30H30N2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-氯-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(11)：黄色粉末,产率: 60%，Mp:163-166℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.61(q,J=8.0 Hz,3H),7.33-7.12(m,4H),6.75-6.50(m,3H),4.24(t,J=6.7 Hz,2H),4.01(t,J=5.5 Hz,2H),3.85(t,J=9.3 Hz,9H),2.13-1.92(m,2H),1.89-1.74(m,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.78(s),168.19(s),166.40(s),153.31(s),147.29(s),141.79(s),140.45(s),139.85(s),134.94(s),127.78(s),125.93(s),123.27(s),122.80(s),119.63(s),115.04(s),112.26(s),112.23(s),109.35(s),108.75(s),97.21(s),69.53(s),68.06(s),61.03(s),56.23(s),53.80(s),53.47(s),44.11(s),31.76(s),29.28(s),26.24(s),26.18(s). MS(ESI):534.1(C29H27ClN2O6,[M+H+])。

7-(4-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮(12)：黄色粉末,产率: 63%，Mp:153-156℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.92(d,J=7.8 Hz,1H),7.72(t,J=8.4 Hz,1H),7.48(q,J=8.0 Hz,2H),7.42(dd,J=14.8,7.5 Hz,1H),7.17(s,2H),6.81-6.68(m,2H),5.32(s,1H),4.47(t,J=7.3 Hz,2H),4.15(t,J=5.1 Hz,2H),3.96(t,J=10.3 Hz,9H),2.25-2.09(m,2H),1.98(s,2H).13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 182.79(s),168.20(s),166.33(s),153.32(s),147.28(s),141.21(s),139.87(s),135.31(s),127.78(s),125.96(s),125.46(s),123.78(s),121.87(s),115.13(s),112.29(s),112.22(s),110.42(s),108.76(s),97.22(s),68.03(s),61.03(s),56.23(s),53.45(s),44.77(s),26.86(s),26.26(s). MS(ESI):568.2(C30H27F3N2O6,[M+H+])。

2.2体外抗肿瘤活性化合物4-12的体外抗肿瘤活性实验结果见表1。化合物4-12对MGC-803细胞株和MCF-7细胞株更为敏感，IC50值基本小于100 μmol/L。化合物8和11对胃癌细胞MGC-803的抑制作用优于阳性对照药5-氟尿嘧啶。其中，化合物8的体外抗肿瘤活性最好，对胃癌细胞MGC-803、乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2的IC50值分别为20.47±2.07 μmol/L、43.42±3.56 μmol/L和35.45±2.03 μmol/L，均优于阳性对照药5-氟尿嘧啶。

3　讨　　论

近年来，恶性肿瘤的发病率呈上升趋势，是当前严重威胁人类健康的疾病之一，常用治疗以化疗为主。但大多数化疗药物毒性大、不良反应多等原因限制了其在临床方面的应用。黄酮类化合物因其潜在的肿瘤治疗效果和可靠的治疗安全性已受到国内外学者的广泛关注[12-13]。而苯并咪唑类化合物具有广泛的生物活性，近些年其抗肿瘤活性方面的研究和开发活跃，进展迅速[14-15]。根据药效基团拼合原理，在本研究中共合成了9个黄酮苯并咪唑衍生物，通过体外抗肿瘤活性评价发现，黄酮苯并咪唑衍生物具有良好的抗肿瘤作用。由于碳链数的差异并不大，在本研究中链长的增加对体外抗肿瘤活性的影响并不显著。其中化合物8体外抗肿瘤活性较好，优于阳性对照药5-氟尿嘧啶，值得进一步探究其抗肿瘤活性与活性机制，为寻找新型的靶向抗肿瘤药物提供新的思路。

表1　化合物对肿瘤细胞体外抗活性的测定