没食子酸诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的机制研究

张庭秀，马李杰，范贤明，肖贞良

（1.西南医科大学附属医院 呼吸内科，四川 泸州 646000；2.中国人民解放军成都军区总医院 呼吸内科，四川 成都 610083）

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在各系统肿瘤中均居首位，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌病例的85%以上，是肺癌中最常见的类型[1]，且NSCLC发病机制复杂，尚无根治疗法。目前，NSCLC的临床治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等，均取得了一定疗效。但NSCLC 5年生存率仍低于15%[2]，且很多患者不能耐受放化疗带来的毒副作用，同时对靶向药物产生耐药现象。中药多取自于各种天然物质，对人体的副作用小，在抗肿瘤方面已展现出独有特色。没食子酸（gallic acid, GA）是广泛存在于绿茶、葡萄等植物中的一种天然植物多酚化合物，在抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面具有广泛的生物学效应[3]。近年来，其抗肿瘤活性已在宫颈癌、口腔鳞癌、胰腺癌及胶质瘤等多种类型的肿瘤细胞中得到证实[4]，但其对NSCLC的作用及机制的相关报道较少。本研究目的在于探究GA对NSCLC A549细胞凋亡的影响及其可能的分子机制，为没食子酸应用于NSCLC的治疗提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

A549细胞（上海拜力生物科技有限公司），无血清细胞冷冻保存培养基（RPMI 1640）及胰蛋白酶（美国Hyclone公司），青霉素链霉素溶液及胎牛血清（美国Gibco公司），Annexinv-FITC/PI凋亡检测试剂盒、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、增强化学发光试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），没食子酸（纯度＞98%）（上海源叶生物科技有限公司），qRT-PCR引物（成都擎科梓熙生物科技有限公司），β-actin及磷酸化酪氨酸激酶1（p-JAK1）抗体（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司），酪氨酸激酶1（JAK1）、B淋巴细胞瘤2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化信号转导与转录激活因子3（p-STAT3）抗体及辣根过氧化物酶标记二抗IgG（武汉博士德生物科技有限公司），信号转导与转录激活因子3（STAT3）抗体（美国Omnimabs公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），二氧化碳培养箱及酶标仪（美国Thermo公司），流式细胞仪（德国Tecpar公司），全自动凝胶成像分析系统（美国UVP公司）。

1.2 细胞培养

A549细胞用含10%胎牛血清、100 μ/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基于5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下培养，每隔2～3 d用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，按1︰2传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测GA对A549细胞增殖的影响

采用RPM 1640完全培养基调整A549细胞密度至1×106个/ml，每孔200 μl接种于96孔板中，当细胞生长至70%时去除培养基，随机分为对照组与不同浓度GA组，GA组每孔分别加入GA终浓度为12、20和28 μg/ml的培养基200 μl；对照组每孔加入200 μl完全培养基，每组3个复孔。培养24 h后，去除培养基，每孔加入90 μl正常培养基及10μl MTT溶液，继续培养4 h后去除培养液，每孔加入二甲基亚砜110 μl，摇床上低速振荡10 min，酶标仪检测492 nm各孔吸光度（OD）。细胞生存率=（药物组OD值/对照组OD值）×100%，以上实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

调整A549细胞密度至2×106个/ml，接种于6孔板中，每孔2 ml，培养至细胞长满底部70%时去除培养基，随机分为对照组与不同浓度GA组，GA组分别加入GA终浓度为12～28 μg/ml的培养基2 ml，对照组加入完全培养基2 ml。培养24 h后收集细胞，4℃预冷磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤、离心、收集细胞，重悬于1×Blinding Buffer液中，调整细胞密度至2×106个/ml，取100μl细胞悬液加入5 μl Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min，再加入5 μl PI溶液，室温避光孵育5 min，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 Western blot检测细胞中JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3、Bax及Bcl-2蛋白表达

收集正常培养基与不同浓度GA干预24 h后的A549细胞，按全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，并依据BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将上样缓冲液与蛋白样品按1︰5比例混合，100℃水煮10 min使蛋白充分变性。根据蛋白定量检测结果，按等量上样原则，SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后转膜至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白封闭2 h，加入一抗稀释液4℃孵育过夜，复温，洗涤，二抗稀释液室温孵育1 h，洗涤，化学发光试剂盒显色，全自动凝胶成像分析系统测定电泳条带灰度积分。

1.6 qRT-PCR检测细胞中JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA的表达

给予A549细胞不同浓度GA干预24 h后，Trizol法提取各组细胞总RNA，再逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，采用qRT-PCR法测量JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA表达量。GAPDH引物序列正向 ：5'-ACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，反向 ：5'-GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'。STAT3引物序列正向：5'-ACCAAGCGAGGACTGAGCATC-3'，反向：5'-CAGCCAGACCCAGAAGGAGAA-3'。JAK1引物序列正向：5'-ACCAGGATGCGGATAAATAATG-3'，反 向 ：5'-GTTTCCAAGGTAGCCAAGTATTT-3'。Bax引物序列正向：5'-TTTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3'，反向引物为5'-TGCCACTCGGAAAAAGACCTC-3'。Bcl-2引物序列正向：5'-ATCGCCCTGTGGATGACT GA-3'，反向 ：5'-GAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，用基因相对定量法（2-ΔΔCt）计算目的基因表达量。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，均进行正态性检验，多组间样本均数比较前行方差齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GA抑制A549细胞的增殖

实验中予以正常培养基、不同浓度GA干预A549细胞24 h后，MTT法检测细胞生存率，结果显示，12～28μg/ml GA作用24 h后，相对于对照组，GA组中A549细胞生存率分别降低至（80.49±0.17）%、（66.57±0.38）%和（51.81±3.04）%，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），提示GA能抑制A549细胞增殖。进一步两两比较，12 μg/ml组与20μg/ml组和28μg/ml组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（t=4.164和6.910，P=0.014和0.002）；说明GA能抑制A549细胞增殖，且随着GA浓度的增加，其对A549细胞生长抑制作用逐渐增强（见表1）。此外，为进一步明确GA干预时间对A549细胞生长的影响，给予A549细胞28μg/ml GA干预6～48 h，结果显示，随着干预时间的延长，A549细胞生存率逐渐降低，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步两两比较，0 h组与6 h组比较，6 h组中细胞生存率降低（t=7.878，P=0.001）；6 h组与24 h组比较，细胞生存率下降（t=5.329，P=0.006）；6 h组与48 h组比较，48 h组中细胞生存率进一步下降（t=7.630，P=0.002）（见表2）。结果表明，GA呈浓度、时间依赖性抑制A549细胞生长。

2.2 GA浓度依赖性诱导A549细胞凋亡

给予A549细胞正常培养基、不同浓度GA干预24 h，流式细胞术Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率（见图1A），结果显示，对照组细胞凋亡率为（8.06±0.48）%，12～28 μg/m GA组细胞凋亡率依次为（9.77±0.11）%、（13.89±0.47）%和（20.56±0.51）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=118.689，P=0.000），进一步两两比较，12μg/ml GA组与对照组比较，差异无统计学意义（t=-1.667，P=0.171）；20μg/ml GA组与对照组比较，细胞凋亡率增加（5.83±0.45）%（t=-7.867，P=0.001）；28 μg/ml GA组与20 μg/ml GA组比较，细胞凋亡率增加（6.67±0.49）%（t=-9.150，P=0.001），结果表明，GA呈浓度依赖性诱导A549细胞凋亡，见图1B。

表1 不同浓度GA干预A549细胞24 h后各组细胞生存率比较 （%，±s）

表1 不同浓度GA干预A549细胞24 h后各组细胞生存率比较 （%，±s）

组别 细胞生存率对照组100.00±0.00 12 μg/ml GA组80.49±0.17 20 μg/ml GA组66.57±0.38 28 μg/ml GA组51.81±3.04 F值489.203 P值0.000

表2 28μg/ml GA干预不同时间后各组细胞生存率比较（%，±s）

表2 28μg/ml GA干预不同时间后各组细胞生存率比较（%，±s）

组别 细胞生存率0 h组100.00±0.00 6 h组64.45±2.56 24 h组51.81±3.04 48 h组48.50±1.85 F值94.809 P值0.000

2.3 GA对各组细胞中JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平的影响

给予A549细胞正常培养基、12～28 μg/ml GA干预24 h后，qRT-PCR检测细胞中JAK1、STAT3、Bax、Bcl-2 mRNA表达，结果显示，12 μg/ml GA组与对照组、28μg/ml GA组比较，随着GA浓度增加，GA组中BaxmRNA表达逐渐升高（t=-4.721和-7.149，P=0.002和0.000），Bcl-2 mRNA表达逐渐降低（t=3.641和7.715，P=0.007和0.000），但各组细胞中JAK1、STAT3 mRNA表达差异无统计学意义（F=1.012和0.081，P=0.436和0.968）。见图2。

2.4 GA对A549细胞中JAK1、STAT3、p-JAK1、p-STAT3及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

通过Western blot检测不同浓度GA干预24 h对A549细胞中JAK1、STAT3及其磷酸化活性形式和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响，探究其凋亡相关机制。结果显示，随着GA浓度的增加，12μg/ml GA组与对照组、28μg/ml GA组比较，GA浓度依赖性降低细胞中p-JAK1（t=2.978和8.212，P=0.041和0.001）及Bcl-2蛋白表达（t=7.520和2.932，P=0.002和0.043），增加Bax蛋白表达（t=-2.901和-4.647，P=0.044和0.010）；此外，12μg/ml GA组与对照组比较，p-STAT3表达差异无统计学意义（t=0.728，P=0.507），但20 μg/ml GA组与对照组、28μg/ml GA组比较，p-STAT3的表达逐渐降低（t=6.907和4.874，P=0.002和0.008），见图3、4。

图1 各组细胞凋亡率

图2 各组细胞中STAT3、JAK1、Bax、Bcl-2 mRNA表达

图3 不同浓度GA对A549细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

图4 不同浓度GA对A549细胞中JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响

3 讨论

细胞死亡有2种途径，①病理性死亡，即坏死；②生理性死亡，即凋亡。细胞凋亡是细胞在一定条件下遵循自身遗传基因决定的调控程序，自动结束生命周期的过程。但细胞凋亡并非全都是自发的程序性死亡，当外界环境影响细胞后，也会诱导细胞凋亡。而肿瘤的发生不仅与细胞的增殖和分化异常有关，也与细胞的异常凋亡有关，因此，诱导肿瘤细胞凋亡也是许多抗肿瘤药物主要作用机制[5-7]。本研究采用MTT法及流式细胞术观察不同浓度GA干预A549细胞不同时间对A549细胞增殖、凋亡的影响。结果显示，随着GA浓度的增加，干预时间的延长，A549细胞存活率逐渐降低，而凋亡率逐渐增加，且GA与A549细胞存活率及凋亡率之间存在浓度、时间依赖关系，与郗艳丽等[8]研究结果一致。以上结果表明，GA通过抑制A549细胞增殖、诱导其凋亡实现抗肿瘤作用，但具体机制有待进一步研究。

肿瘤的发生是多因素、多机制参与的结果，涉及到一系列信号通路的改变，如MAPK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3等信号通路[9-10]。在GA抗肿瘤作用的相关研究中，LIANG[11]、HE[4]等已证实，GA通过干预PI3K、MAPK等信号通路发挥其抗肿瘤作用；但尚未见GA在肿瘤细胞JAK/STAT3信号通路中作用的相关性研究报道。

JAK/STAT3信号通路主要由JAK蛋白酪氨酸激酶（JAK）及信号转导与转录激活因子3（STAT3）组成，当细胞表面受体与配体如白细胞介素6（IL-6）或表皮生长因子（EGFR）等结合时，可使受体酪氨酸激酶JAK磷酸化，进而激活胞浆中的STAT3单体，该STAT3单体被p-JAK激活后发生二聚化，形成p-STAT3，然后穿过核膜进入核内调节相关基因的表达，进而调控细胞增殖、分化、凋亡等[12-13]。在正常细胞中，STAT3蛋白呈短暂性激活，而肿瘤细胞中的STAT3蛋白则被持续性激活，以促进肿瘤细胞的生长、增殖并抑制细胞凋亡[14]。此外，有研究发现，NSCLC细胞系中普遍存在STAT3的激活，且免疫组织化学技术检测也发现55%的NSCLC组织中存在STAT3的激活[15]，表明STAT3的激活与NSCLC的发生有关，而抑制STAT3的激活可阻断肿瘤细胞中STAT3信号通路，为许多癌症患者提供一种新的治疗方法。

本研究采用qRT-PCR及Western blot检测细胞中STAT3信号通路相关基因和蛋白的表达。结果显示，随GA浓度的增加，A549细胞中JAK1、STAT3基因转录及蛋白表达水平无显著变化，但GA呈剂量依赖性抑制STAT3信号通路中JAK1、STAT3蛋白的磷酸化，进而抑制STAT3信号通路的激活，下调抗凋亡蛋白Bcl-2、上调促凋亡蛋白Bax的基因转录及蛋白表达，最终启动肿瘤细胞凋亡程序，诱发细胞凋亡。

综上所述，GA对A549细胞具有生长抑制及凋亡诱导作用，该作用是通过抑制STAT3的磷酸化激活，进而抑制STAT3信号通路而实现，这进一步完善了GA抗肿瘤作用机制的研究，为GA应用于NSCLC的临床治疗奠定了理论基础，但应用于临床仍需进一步药物毒性实验及体内实验研究的支持。