miR-106a对小鼠卵巢癌移植瘤生长的影响研究

蔡智慧，李鹏，梁义娟，石军荣，苏媛媛，谢丹，刘竞芳

（1.河北大学附属医院 妇科，河北 保定 071030；2.河北大学附属医院 超声科，河北 保定 071030；3.河北省保定市第一医院 超声科，河北 保定 071000）

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，患者的复发率和死亡率均较高。卵巢癌细胞增殖、侵袭能力较强，且目前尚缺乏治疗卵巢癌的靶向药物是造成卵巢癌患者预后较差的重要原因。因此，寻找卵巢癌的治疗靶点对改善卵巢癌患者的预后具有积极的价值。微小RNA（MicroRNA, miRNA）是一类在细胞内发挥多种生物学作用的非编码小分子RNA，能够调节靶基因的转录和翻译过程并影响细胞的增殖、侵袭及血管新生。miRNA-106a（miR-106a）是近年来发现的具有原癌基因特性的miRNA，能够靶向抑制癌细胞内多种抑癌基因的表达。在恶性肿瘤的发生和发展过程中，miR-106a的高表达会抑制抑癌基因的表达并增强癌细胞的恶性生物学行为[1]。已有研究报道，miR-106a对卵巢癌细胞的体外增殖、侵袭具有促进作用[2]，但关于miR-106a对癌细胞在体条件下增殖、侵袭的影响并未明确。本研究复制小鼠卵巢癌移植瘤模型并分析瘤内注射miR-106a对卵巢癌移植瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SKOV3卵巢癌细胞株购自中国科学院上海细胞库，RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自上海Hyclone公司，LipofectamineTM2000购自上海Invitrogen公司，miR-106a抑制剂、阴性对照的抑制剂由上海吉玛公司合成，SPF级BALB/c小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，RNA抽提试剂盒、互补DNA（complementary DNA, cDNA）第一链合成试剂盒实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购自北京天根生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠卵巢癌移植瘤模型的复制 培养SKOV-3细胞，用0.125%的胰蛋白酶消化传代，取传代后且处于对数生长期的SKOV-3细胞，离心后用无血清培养基重悬细胞并调节密度至1×107个/ml，取0.5 ml细胞悬液并进行皮下注射，注射部位为小鼠右前肢腋窝外侧，注射后7 d测量肿瘤体积，以肿瘤体积3～4 mm3判断为模型复制成功，用于后续分组和实验。

1.2.2 卵巢癌移植瘤小鼠的分组和干预 取卵巢癌移植瘤小鼠，随机分为空白对照组、阴性对照组、miR-106a抑制组，每组各8只，干预方法：①空白对照组：瘤内注射100 μl生理盐水与3 μl LipofectamineTM2000试剂的混合液；②阴性对照组：瘤内注射95 μl生理盐水、5 μl阴性对照抑制剂、3 μl LipofectamineTM2000试剂的混合液；③miR-106a抑制组：瘤内注射95μl生理盐水、5 μl miR-106抑制剂、3 μl LipofectamineTM2000试剂的混合液。每隔4 d注射1次，并用游标卡尺测量肿瘤的最大长径和最大横径，以0.5×最大长径×最大横径×最大横径计算肿瘤体积。

1.2.3 基因mRNA表达的检测 干预后第40天，测量肿瘤体积后处死小鼠，解剖得到移植瘤组织后采用RNA抽提试剂盒分离组织中的总RNA，而后采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；取cDNA样本进行qRT-PCR扩增，分别扩增人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/AKT）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、生存素（Survivin）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、MMP-9、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、β-肌动蛋白（β-actin），以 βactin为内参照计算PTEN、PI3K、AKT、CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表达。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组比较采用方差分析、两两比较采用LSD-t检验，多时间的比较采用重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘤体体积的变化情况

空白对照组、阴性对照组、miR-106a抑制组干预前、干预后10、20、30和40 d时瘤体体积比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①空白对照组、阴性对照组、miR-106a抑制组之间的瘤体体积有差异（F=17.685，P=0.000）；②每组内不同时间点的瘤体体积有差异（F=13.489，P=0.000）；③各组瘤体体积变化趋势有差异（F=16.328，P=0.000）。见表1。

2.2 肿瘤组织中PTEN、PI3K、AKT的表达

干预后40 d时，空白对照组、阴性对照组、miR-106a抑制组移植瘤小鼠肿瘤组织中PTEN、PI3K、AKT表达的分析如下：miR-106a抑制组小鼠肿瘤组织中PTEN的mRNA表达高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05），PI3K、AKT的mRNA表达低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。见表2。

2.3 肿瘤组织中信号通路下游分子的表达

干预后40 d时，空白对照组、阴性对照组、miR-106a抑制组移植瘤小鼠肿瘤组织中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF表达的分析如下：miR-106a抑制组小鼠肿瘤组织中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表达低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。见表3。

表1 3组移植瘤小鼠瘤体体积的变化情况 （n =8，mm3，±s）

表1 3组移植瘤小鼠瘤体体积的变化情况 （n =8，mm3，±s）

注：1）与空白对照组比较，P ＜0.05；2）与阴性对照组比较，P ＜0.05；3）与干预前比较，P ＜0.05；4）与干预后10 d比较，P ＜0.05；5）与干预后20 d比较，P ＜0.05；6）与干预后30 d比较，P ＜0.05

组别 干预前 干预后10 d干预后20 d干预后30 d干预后40 d miR-106a抑制组5.90±0.8246.97±6.941）2）3）92.52±10.251）2）3）4）135.65±17.851）2）3）4）5）188.42±22.461）2）3）4）5）6）阴性对照组5.98±0.91115.14±18.023）227.14±39.243）4）390.15±45.613）4）629.14±81.253）4）空白对照组5.92±0.78114.52±16.793）225.96±37.823）4）387.87±42.623）4）624.51±78.783）4）

表2 3组移植瘤小鼠肿瘤组织中PTEN、PI3K、AKT的表达 （n =8，±s）

表2 3组移植瘤小鼠肿瘤组织中PTEN、PI3K、AKT的表达 （n =8，±s）

注：†与阴性对照组和空白对照组比较，P ＜0.05

组别PTENPI3KAKT miR-106a抑制组2.65±0.39†0.38±0.09†0.41±0.08†阴性对照组1.05±0.141.06±0.171.02±0.15空白对照组1.00±0.161.00±0.121.00±0.18 F值23.95120.28512.582 P值0.0000.0000.002

表3 3组移植瘤小鼠肿瘤组织中信号通路下游分子的表达 （n =8，±s）

表3 3组移植瘤小鼠肿瘤组织中信号通路下游分子的表达 （n =8，±s）

注：†与阴性对照组和空白对照组比较，P ＜0.05

组别CyclinD1SurvivinMMP-2MMP-9VEGF miR-106a抑制组0.35±0.08†0.32±0.06†0.39±0.06†0.28±0.05†0.23±0.04†阴性对照组0.98±0.141.03±0.151.05±0.161.07±0.120.97±0.16空白对照组1.00±0.151.00±0.181.00±0.141.00±0.171.00±0.15 F值18.35221.34816.84328.68222.155 P值0.0000.0000.0000.0000.000

3 讨论

卵巢癌的发病机制目前仍未明确，临床上也缺乏治疗卵巢癌的靶向药物。miRNA是近年来新发现的一类具有广泛生物学活性的非编码小分子RNA，能够与靶基因mRNA的3'-非翻译区结合并造成mRNA降解或抑制mRNA翻译。miR-106a是具有原癌基因活性的miRNA，已有多项研究发现，miR-106a在胃癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]等多种恶性肿瘤组织中呈高表达趋势，且与癌细胞的增殖活力、侵袭活力密切相关。国内李敏等[2]的研究报道，miR-106a对卵巢癌细胞的体外增殖、侵袭具有促进作用，但是关于miR-106a对卵巢癌组织生长的影响未见报道。本研究以卵巢癌移植瘤小鼠作为研究对象，通过瘤内注射miR-106a的方式来分析卵巢癌组织中miR-106a的生物学作用，进而对肿瘤组织的生长情况进行评价，结果显示：干预后10、20、30和40 d时，miR-106a抑制组移植瘤小鼠的瘤体体积均低于空白对照组和阴性对照组。这就说明miR-106a抑制剂对卵巢癌移植瘤的生长具有抑制作用。

miRNA发挥生物学作用主要依赖于对靶基因表达的靶向调控，miR-106a在恶性肿瘤的病情发展变化过程中起到促进作用且对多种促凋亡基因、抑癌基因的表达具有靶向抑制作用。PTEN基因是体内重要的抑癌基因之一，也是受到miR-106a调节的靶基因之一[6-7]。PTEN基因所编码的蛋白能够是细胞内的第二信使PIP3脱去3'-磷酸，进而影响下游PI3K/AKT信号通路的激活。在卵巢癌的发生和发展过程中，PTEN的表达减少，低表达的PTEN会造成PI3K/AKT激活并促进细胞的增殖、侵袭及血管新生。通过分析移植瘤组织中PTEN/PI3K/AKT的表达可知，miR-106a抑制组小鼠肿瘤组织中PTEN的mRNA表达高于空白对照组和阴性对照组，PI3K、AKT的mRNA表达低于空白对照组和阴性对照组。这就说明miR-106a能够靶向调控卵巢癌组织中PTEN的表达，抑制miR-106a能够增加PTEN的表达并抑制PI3K/AKT的激活。

PTEN所调控的PI3K/AKT信号通路具有广泛的生物学效应，细胞的增殖、侵袭、血管新生等生物学过程均受到该信号通路的调控。PI3K发生磷酸化后能够将底物磷脂酰肌醇4，5-二磷酸转变为PI3P，后者能够使AKT发生磷酸化并调节多种增殖、侵袭、血管新生相关靶基因的表达[8-9]。CyclinD1和Survivin是受到AKT调控的增殖相关基因，前者能够与CDK4、CDK6形成复合物并加速细胞周期，后者能够拮抗多种Caspase分子并抑制细胞凋亡；MMP-2和MMP-9是MMPs家族中受到AKT调控的成员，能够通过降解细胞外基质的方式促进细胞侵袭；VEGF是受到AKT调控的血管新生血管基因，是目前已知促血管新生作用最强的细胞因子。本研究通过分析移植瘤组织中上述增殖、侵袭、血管新生相关靶基因的表达量可知：miR-106a抑制组小鼠肿瘤组织中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的mRNA表达低于空白对照组和阴性对照组。说明miR-106a对卵巢癌组织中CyclinD1、Survivin、MMP-2、MMP-9、VEGF的表达具有调节作用，抑制miR-106a能够减少增殖、侵袭、血管新生相关靶基因的表达。

综上所述，miR-106a对卵巢癌组织中PTEN/PI3K/AKT通路具有靶向调节作用；瘤内注射miR-106a抑制剂能够通过增强PTEN信号通路来抑制卵巢癌移植瘤小鼠的肿瘤生长。