细菌感染多重核酸检测试剂参考品的建立

刘东来，周海卫，石大伟，沈　舒，田亚宾，张春涛

细菌感染可以引发多种疾病，临床上须要及时诊断。传统细菌鉴定基于培养法，是将患者体液标本置于适宜的培养基上培养增殖，然后鉴定培养物。但是，培养法对临床样本消耗量大且检测周期长，难以分辨多种细菌混合感染，以及很多致病性细菌难以分离培养等，导致传统的鉴定方法有时不能满足临床诊断需求[1-2]。分子诊断技术检测速度快，灵敏度、特异性和可重复性好，在突发性感染的评估，感染早期的发现、监测以及细菌耐药性分析等领域占据重要地位[3-5]。随着分子诊断技术的快速发展以及临床需求的不断增加，多重核酸检测技术应运而生。该技术是指在一个核酸检测体系中加入多对扩增引物，同时对多个病原体进行靶向扩增。通过与其他检测技术联用，多重核酸检测技术能够同时对一份样本检测多种病原体并快速报告结果，该项技术正越来越多地应用于临床诊断并受到广泛关注[6-10]。常见的多重核酸检测试剂的方法包括PCR、熔解曲线、等温扩增以及第二代测序技术（又称高通量测序或下一代测序技术）等[11-12]。目前，FDA已经批准12个单次可检测20余种细菌感染的多重核酸检测试剂，检测范围覆盖中枢神经系统、血液、呼吸道、肠道以及生殖道感染相关细菌[13]。我国的相关行业尚处于起步阶段，国家食品药品监督管理总局仅批准1个基于等温扩增技术的细菌多重核酸检测试剂。

参考品是相关试剂质量评价的基础以及审评审批的重要依据[14-17]。为适应细菌多重核酸检测试剂的性能特点，须要建立创新性的质量评价方法。本研究建立了细菌感染多重核酸检测试剂参考品并制定其质量标准。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 候选参考品来源 候选参考品包括28株细菌，分别是屎肠球菌ATCC 700221、肺炎链球菌ATCC BAA-255、粘质沙雷氏菌ATCC 27137、大肠杆菌ATCC 43888、表皮葡萄球菌ATCC 12228、鲍曼不动杆菌ATCC 9955、肺炎克雷伯菌BAA-1705、缓症链球菌ATCC 15914、粪肠球菌ATCC 700802、产酸克雷伯菌ATCC 13182、化脓链球菌ATCC 19615、流感嗜血杆菌ATCC 10211、金黄色葡萄球菌ATCC BAA-1747、奇异变形杆菌ATCC 29906、无乳链球菌ATCC 13813、单核细胞增多李斯特菌ATCC 19115、阴沟肠杆菌ATCC 13047、铜绿假单胞菌ATCC 27853、脑膜炎奈瑟菌ATCC 43744、藤黄微球菌ATCC 49732、马红球菌ATCC 6939、格氏李斯特菌ATCC 700545、琼氏不动杆菌ATCC 17908、副流感嗜血杆菌ATCC 9796、干燥奈瑟菌ATCC 9913、荧光假单胞菌ATCC 13525、嗜水气单胞菌ATCC 7966、嗜肺军团菌ATCC 33152；6株真菌分别是近平滑念珠菌ATCC 90875、葡萄牙假丝酵母ATCC 34449、热带假丝酵母ATCC 66029、克柔念珠菌ATCC 90878、光滑念珠菌ATCC 15545、白色念珠菌ATCC 10231。上述菌株均由本单位保存并提供。

1.1.2 仪器和试剂 细菌培养使用脑心浸液培养基、甘露醇琼脂培养基、哥伦比亚琼脂培养基、哥伦比亚血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基、军团菌GVPC选择琼脂培养基；厌氧产气袋。细菌鉴定使用革兰阴性细菌鉴定卡（VITEK2 GN）；革兰阳性细菌鉴定卡（VITEK2 GP）；奈瑟氏菌及嗜血杆菌鉴定卡（VITEK2 NH）；酵母菌鉴定卡（VITEK2 YST）；革兰阴性细菌药物敏感性（药敏）鉴定卡（VITE2 ASTGN）；革兰阳性细菌药敏鉴定卡（VITEK2 ASTGP）。上述培养基及鉴定卡均购自梅里埃诊断产品（上海）有限公司。细菌生化鉴定使用的全自动细菌鉴定及药敏分析系统（VITEK2）由梅里埃诊断产品（上海）有限公司提供。细菌全基因组测序验证应用的第二代测序服务购自华大基因。

候选参考品协作标定使用的多重核酸检测的商品化或自建试剂包括呼吸道病原菌核酸检测试剂盒、致病性细菌核酸检测试剂盒、侵袭性真菌核酸检测试剂盒、血培养病原体及其耐药基因检测试剂盒、血流感染常见病原体检测试剂盒和细菌感染检测试剂盒，由博奥生物集团有限公司、华大基因、卡尤迪生物科技（北京）有限公司以及梅里埃诊断产品（上海）有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养及鉴定 本单位保存的34株细菌和真菌均为冻干粉状态。一般地，菌株先加入200 μl肉汤培养基复溶，混匀后划线接种于合适的固体培养基平板，35 ℃孵育培养24～36 h。挑取单个菌落，置于35 ℃孵育培养24～36 h传代培养。屎肠球菌和粪肠球菌培养使用脑心浸液培养基；金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌培养使用甘露醇琼脂培养基；马红球菌、藤黄微球菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、近平滑念珠菌、葡萄牙假丝酵母、热带假丝酵母、克柔念珠菌、光滑念珠菌和白色念珠菌培养使用哥伦比亚琼脂培养基；化脓链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、缓症链球菌和阴沟肠杆菌培养使用哥伦比亚血琼脂培养基；单核细胞增多李斯特菌、格氏李斯特菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌和干燥奈瑟菌使用巧克力琼脂培养基；鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和粘质沙雷氏菌培养使用大豆酪蛋白琼脂培养基；嗜肺军团菌使用军团菌GVPC选择琼脂培养基。须要注意的是：化脓链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、缓症链球菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、干燥奈瑟菌和嗜肺军团菌须要使用厌氧产气袋进行厌氧培养，其中嗜肺军团菌生长缓慢，须培养96～120 h。

菌株的鉴定使用全自动细菌鉴定及药敏分析系统及其配套鉴定卡，所有操作按照仪器及鉴定卡说明书进行。

1.2.2 菌株浓度测定 应用梯度稀释法对鉴定正确的菌株的菌落形成单位浓度进行测定[18]。简单的，菌株重新划线接种于合适的固体培养基平板进行培养。使用3 ml无菌生理盐水冲洗固体培养基表面的菌落，并配制一定麦氏浊度单位的菌悬液，细菌按照0.5 MCF约为1.0×108CFU/ml估算，真菌按照0.5 MCF约为1.0×106CFU/ml估算。将上述菌悬液按10倍梯度进行稀释，取100 μl稀释液划线接种于合适的固体培养基平板上培养24～36 h。选择菌落数为30～300个的平板进行人工计数并计算原始菌液的浓度。所有实验重复2次并计算平均值。

1.2.3 混合样本制备及验证 将34株已知浓度的菌株进行分组、混合，参考FDA颁布的病原体多重核酸检测试剂指导原则[19-22]，WHO公布的第一代细菌混合参考品[23]，以及在美国批准上市的相关试剂的临床数据[24-25]，制定本参考品的混合原则。其中主要包括：同一混合样本中的菌株数量不超过5株，其浓度应尽量相近且避免全部为革兰阳性细菌、革兰阴性细菌或真菌[19-22]。混样本中的菌株应为较高浓度，细菌应约为 1×108～ 1×109CFU/ml，真菌应约为1×106～ 1×107CFU/ml。实验室操作应避免交叉污染。

混合样本制备完成后进行测序验证。委托华大基因应用第二代测序技术对样本中所有菌株的全基因组进行测序，以验证混合样本中菌株的组成及交叉污染情况。

1.2.4 协作标定及质量标准的制定 经过培养、浓度测定、混合及鉴定的混合样本组成细菌性感染多重核酸检测试剂候选参考品。协作标定使用4家公司的7个检测试剂（盲编为A～G），根据各自产品特点对候选参考品进行适当稀释后，按照说明书进行检测。所有参考品均封盲检测，检测结果汇总后再行揭盲。根据协作标定的有效结果，最终确定参考品质量标准。

1.2.5 稳定性试验 取一套参考品置于室温条件（约25 ℃）下进行3次反复冻融处理，然后使用一种多重核酸试剂进行检测，并委托华大基因进行测序。检测结果与正常储存（-20 ℃）的参考品进行比较，以考核参考品的冻融稳定性。此外，还将对参考品长期稳定性进行监测，计划每年2次。

2　结　果

2.1 参考品组成 本研究选择34株临床上可导致脑膜炎，败血症，呼吸道、肠道及生殖道等感染的致病性细菌和真菌。全部菌株经过培养、全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定正确后并测定浓度，最后进行分组混合。34株高浓度的细菌和真菌被分成7组（M1～M7），其中M1～M6分别包含5种病原体，M7包含4种病原体。此外，每个混合样本中均含有革兰阳性细菌、革兰阴性细菌或真菌。参考品具体组成见表1。

表1 参考品组成Table 1 Composition of reference material

2.2 参考品验证 应用第二代测序技术，分别对混合参考品M1～M7中菌株的全基因组进行测序验证，结果见表2。结果显示M1中5种细菌的总序列占比为99.4%；M2～M5中5种细菌和真菌的总序列占比分别为：90.1%、99.0%、98.7%、98.7%、99.1%；M6中5种细菌的总序列占比为97.7%；M7中4种细菌和真菌的总序列占比为97.7%。分析测序结果，M1～M7中的细菌和真菌的组成与预期相符，且参考品特异性经过验证不存在交叉反应。

2.3 协作标定及质量标准的制定 参加协作标定的7个试剂（试剂A～G）的检测方法包括PCR-熔解曲线、等温扩增和第二代测序技术。试剂A～C为基于等温扩增技术的多重核酸检测试剂，检测范围分别包括13种下呼吸道细菌、16种致病性细菌和16种侵袭性真菌；试剂D为基于PCR和熔解曲线技术的多重核酸检测试剂，检测为24种血流感染相关细菌和真菌；试剂E～G为基于第二代测序技术（包括华大基因、Illumina和赛默飞世尔公司的高通量测序平台）的多重核酸检测试剂，其中试剂E的为25种血流感染相关细菌和真菌，试剂F和G靶向性检测细菌16S rRNA基因。

表2 参考品测序验证结果Table 2 Results of reference materials sequencing

协作标定结果见表3。试剂A检测出9种细菌；试剂B检测出15种细菌；试剂C检测出5种真菌；试剂D和E均检测出24种细菌和真菌；试剂F检测出10种细菌；试剂G检测出25种细菌。根据各试剂产品说明书，试剂A～E对于检测范围内的细菌和真菌均检出，且不在检测范围内的细菌和真菌均未检出；试剂F和G未检出的细菌数分别为18种和3种。

参考品M1～M7进行10倍系列梯度稀释后，分别使用试剂B、C和D检测，结果见表4。检测原倍、10倍稀释和100倍稀释的M1～M7时，试剂B和D的检测结果均符合预期，试剂C则未能检测到100倍稀释的M5中的近平滑念珠菌。检测1000倍和10 000倍稀释后的M1～M7时，试剂B、C和D未检出的菌株数量均较多（数据未展示）。此外，参考品在各稀释梯度均未发生交叉反应。

表3 参考品协作标定结果Table 3 Results of collaboration study

2.4 参考品稳定性 参考品M1～M7置于室温条件（约25 ℃）下反复冻融3次处理后，与-20 ℃保存且未经冻融处理的参考品均使用试剂D进行检测，参考品M3和M6进行全基因组测序，检测结果见表5。分析结果显示，反复冻融3次处理并未影响参考品的稳定性。

表4 梯度稀释参考品检测结果Table 4 Results of detecting gradient dilution of reference material

3　讨　论

多重核酸检测技术在多重病原体诊断领域的应用带来了更好的时效性、准确性以及灵敏度[8]。FDA不仅先后批准了多个多重核酸诊断试剂产品，更重要的是其颁布的4个专项指导原则对此类试剂的发展具有重要指导意义，推动了行业发展[13，19-22]。而目前我国仍缺少多重核酸诊断试剂相关的专项法规或指南。病原体核酸检测试剂参考品是经过鉴定的具有代表性的一系列临床分离培养样本或模拟样本，按照特定组成形式建立的，是相关试剂质量控制和评价的核心以及产品审评过程的重要依据之一[17]。传统单一病原体核酸检测试剂的参考品组成一般包括数个阳性参考品、阴性参考品、重复性参考品以及最低检出限参考品，用以全面评价试剂的准确性、特异性、重复性和灵敏度等核心性能[14-16]。如按上述思路，以某个试剂的检测能力为24种细菌为例，须要设置500余个参考品。基于数量庞大的参考品的质量评价体系，不仅对于企业和监管部门是沉重的负担，更严重的是由于缺少混合形式的参考品，该评价体系不能针对多重核酸检测试剂的技术特点进行全面评价。因此，美国监管部门建议使用混合样本评价多重核酸检测试剂的性能[19-22]。

表5 稳定性检测结果Table 5 Results of stability test

本研究建立的细菌感染多重核酸检测试剂参考品，由7支混合参考品组成，包括了34株经过鉴定和验证且浓度已知的致病性细菌和真菌。参考品制备完成后应用不同试剂进行协作标定并根据检测结果确定质量标准：阳性符合率（即准确性）应为检测经稀释（终浓度应不低于1.0×105CFU/ml）的混合参考品M1～M7，在产品检测范围内的病原菌均应检出，且与已知型别相符，不在产品检测范围内的病原菌均不应检出；阴性符合率（即特异性）应为检测经稀释（终浓度应不低于1.0×105CFU/ml）的混合参考品M1～M7，不在产品检测范围内的病原菌均不应检出；重复性应为检测稀释至低浓度（不高于产品宣称最低检出限的10倍）的混合参考品M1～M7，分别重复检测10次，在产品检测范围内的病原菌均应检出，且与已知型别相符，不在产品检测范围内的病原菌均不应检出；最低检出限应为检测经10倍系列稀释的混合参考品M1～M7，终浓度为产品宣称的最低检出限浓度及以上时，在产品检测范围内的病原菌均应检出，且与已知型别相符，不在产品检测范围内的病原菌均不应检出。本研究对参考品的冻融稳定性进行了详细考察，但是仍缺少参考品长期稳定性数据，在后续研究中应补充完整并持续监测。

本参考品具有以下优势：一是能大幅减少参考品数量；二是能够考察试剂对多个待测菌株的混合样本的分辨率；三是能够考察非待测菌株对待测菌株的干扰；四能够考察样本中高浓度背景核酸对低浓度待测核酸的干扰。然而作为第一代参考品，其所覆盖的病原菌数量有限，后续换批、换代过程中应考虑逐渐增加菌株数量并适当提高其质量标准。