球孢白僵菌4种菌株防治柳膜肩网蝽的温度效应研究

赵俊芳，樊金华，冀卫荣

（山西农业大学林学院，山西太谷 030801）

柳膜肩网蝽（Hegesidemus habrus Drake）属半翅目网蝽科网蝽亚科，是危害柳树等树木叶片的一种刺吸式害虫[1-3]。柳膜肩网蝽不仅通过吸食叶片汁液破坏叶片的各种细胞器，还分泌大量黑褐色黏稠状物质，堵塞气孔，影响了光合作用和呼吸作用，同时也加重了霉病发生的概率[4-5]，导致叶片大量失绿，树木营养缺失，落叶断枝情况严重，观赏价值大打折扣。柳树是园林植物中生命力旺盛和观赏性强的代表树种[6]，近2 a发现，柳膜肩网蝽在山西省晋中市太谷县柳树上发生危害严重。该虫一年发生4～5代，利用虫生真菌对其进行防治还未见报道，筛选出能替代传统农药的生物控制因子，是对柳网蝽可持续控制的重要手段。

目前，针对柳膜肩网蝽的防治方法主要是物理防治和化学防治。化学药剂的缺点如污染环境、长期使用容易产生抗药性等已不能满足人们的需求，而物理防治不仅效果慢，工作量也大，生物试剂已经成为主流[7]。生物试剂的绿色无污染，受到人们的高度肯定[8]。白僵菌作为重要的昆虫病原真菌，用于防治多种林木害虫[9-12]，在林间使用，极易形成昆虫流行病。白僵菌是通过昆虫体壁进入昆虫，不需要以取食的方式获病，所以，对拥有刺吸式口器的柳膜肩网蝽有针对性防治效果。目前，国内外还没有关于通过虫生真菌防治柳膜肩网蝽的报道。

本试验通过从已选择出的4种相对毒性较高的白僵菌，对柳膜肩网蝽进行毒力测试，最终筛选出1种致病性最高的菌株，同时检测此菌株在不同温度下的致病力，选出最佳施用温度，为今后柳膜肩网蝽的生物防治提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株为球孢白僵菌FDB，JLYT，BF，TST菌株，保存于山西农业大学森林生物显微技术实验室。供试昆虫为柳膜肩网蝽，主要采自山西农业大学试验苗圃试验田中的柳树上。

1.2 试验方法

1.2.1 供试菌株培养及孢子悬浮液的制备 供试4种菌株采用PDA培养基（马铃薯2 g、葡萄糖0.2 g、琼脂0.15～0.2 g、蒸馏水10 mL、自然pH）培养，直到白僵菌完全产孢，在无菌环境下的操作台里，用接菌环将分生孢子分别刮到50 mL的小三角瓶里，分别加入等量的20 mL含0.05%吐温－80的蒸馏水，磁力搅拌器搅拌均匀后，用血球计数板在显微镜下计数，了解孢子悬液的初始浓度，根据所需浓度进行梯度稀释，最终配制出所需的菌液[13-14]。

1.2.2 同浓度的4种白僵菌的高致病力筛选 选取1.0×108孢子/mL的4种球孢白僵菌孢子悬浮液，分别以相等的量均匀地涂抹在捕捉到的网蝽体表，放入准备好的养虫笼中。每菌株3个重复，每个重复30头试虫。对照为0.1%的吐温-80溶液。每个笼中有提前准备好的新鲜柳树枝条，并且在枝条一端绑扎蘸有保鲜液的棉球保湿保鲜。将操作后的试虫放入恒温光照培养箱，每天定时定量更换新鲜柳树枝条。第2天的同一时间所测数据为试验的第一组数据，每天定时对试虫进行统计，直到全部死亡。死后的试虫及时转移到恒温培养箱保湿培养（RH＞95%），以证明试虫是由于感染真菌而死。同时，观察对照组的死亡情况。根据死亡情况，分别计算出4种菌株在1.0×108孢子/mL时的半致死时间LT50。最终得到死亡率最大、LT50最小的高毒力菌株，并对其进行关于温度对菌株致病力影响的研究[15]。

1.2.3 温度对白僵菌致病力的影响 综合考虑死亡率和僵虫率，选择菌株BF进行后续的不同温度对白僵菌致病力的试验[16-17]。操作方法和不同菌株试验的接菌方法相同，用1.0×108孢子/mL的菌液接菌后，将养有试虫的养虫盒放入不同温度恒温培养箱（RH＞95%）。培养箱的温度分别设置为18，22，26，30℃，每个温度3个重复，每个重复30头试虫。从试验的第2天开始观察统计试验组和对照组，统计数值为第1组数据。及时处理死亡试虫，将其放入恒温培养箱（RH＞95%）保湿培养，从而保证试虫是由于感染白僵菌致病而死的。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0数据处理软件进行统计分析[18-19]。

2 结果与分析

2.1 同浓度的4种白僵菌的高致病力筛选

本研究应用1.0×108孢子/mL的虫生真菌菌液，对柳膜肩网蝽成虫进行侵染后，死亡率为70.00%～92.22%，不同菌液造成的试虫死亡率不同，4 种菌株 FDB，JLYT，BF，TST 的死亡率分别为92.22%，73.33%，91.11%，70.00%，不同菌株的毒力明显不同。对试虫死亡率的差异性检验结果显示，菌株FDB，BF与其他菌株死亡率差异显著。对试虫的处理过程中，僵虫率范围是44.44%～84.44%，不同菌株 FDB，JLYT，BF，TST 的僵虫率分别为74.11%，52.22%，84.44%，44.44%；菌株僵虫率的差异性检验显示，菌株BF的僵虫率显著高于其他3种菌株（表1）。说明试虫的死亡主要由真菌感染引起。

表1 1.0×108孢子/mL的4种菌液侵染柳膜肩网蝽成虫的死亡率和僵虫率 %

通过致死中时分析，所选菌株对柳膜肩网蝽的致死中时均在5 d以内。其中，菌株FDB和BF对试虫的LT50均在4 d以内，菌株BF更是小于3 d（表2）。说明菌株BF对柳膜肩网蝽的致死速度最快，其次是菌株FDB。

表2 1.0×108孢子/mL的4种菌液侵染柳膜肩网蝽成虫的半致死时间LT50 d

2.2 温度对白僵菌致病力的影响

通过对不同温度下试虫的校正死亡率比较得出，18～30℃的温度条件均能造成试虫侵染致死；在22～26℃时，BF菌液的致死效应较强，在26℃时致死率达到最高。

在不同恒温（RH＞95%）条件下，BF菌液侵染后的试虫死亡率和僵虫率随温度的变化而改变（图1，2）。在18℃时，试虫的平均死亡率最低，在22，26℃时形成逐渐增加的趋势，并且达到最大值100%；在30℃时平均死亡率回落。同样，僵虫率在18～26℃时呈现上升趋势，到30℃回落。说明试虫死亡是由菌液侵染致死。

3 讨论

在生物防治方面，虫生真菌的选择至关重要，除了考虑菌种对寄主的专化性，还应关注菌株对人畜及环境的影响。本试验所选的4种菌株均通过了科学的验证，对人畜及作物无害，且是针对昆虫的毒性较强的菌株，完全可以直接投入实践。4种菌株制成1×108孢子/mL的菌液，用均匀涂抹的方式感染柳膜肩网蝽，以保证菌液与虫体充分接触和虫体单位面积的受侵染量相同。侵染后，统计死亡率和僵虫率可知，综合考虑二者确定试虫的致死是由于菌液的侵染。结果表明，菌株FDB对柳膜肩网蝽的累计死亡率达到92.22%，在4种菌株中死亡率最高，而菌株BF的死亡率是91.11%，仅次于菌株FDB，但是，菌株BF的僵虫率达到了84.44%，高于其他3种菌株。此外，致死中时LT50也是关于高毒力的一个重要影响因素。致死中时越短，说明菌株的毒性越强，目标害虫的死亡速度越快，防治效果越好。本试验中4种菌株的致死中时均小于5 d，菌株BF和FDB的致死中时小于4 d，BF更是达到了2.33 d的水平。说明所选4种球孢白僵菌对柳膜肩网蝽均有较高的致病力，可作为生物试剂应用于实际防治中。

针对高毒力菌株试验结果，综合考虑死亡率、僵虫率以及致死中时LT50，筛选出菌株BF是4种菌株中具有高毒力、高致病力的菌株。为了在实际生产中更好地使用该菌株，本试验选择单一菌株BF，测试了1×108孢子/mL下不同温度对菌株的致病力的影响[20]。低温会影响球孢白僵菌的萌发和对试虫的侵染，高温会通过提高酶活而影响孢子的活性[21]。研究结果表明，柳膜肩网蝽在18～26℃时的死亡率一直处于上升状态，到26℃时死亡率为100%，对柳膜肩网蝽的致病力最强；温度继续升高，死亡率开始下降。说明随着温度的升高，菌株的致病力并不是持续升高的，而是有一个最适温度范围。

试验中，在1×108孢子/mL的浓度下，筛选出的高致病力菌株BF，死亡率达到了91%以上，半致死时间为2 d左右，在投入实践时，可以考虑在春秋或者夏季的早晚施用BF菌液制备的生物杀虫剂，该菌株毒性可以发挥到最大，杀虫效果更好。