蓝莓果渣发酵乳饮料工艺研究

王俊颖，　关仁梅，　谈雪洁，　吴文娟，　夏敬宇，　翟立公

(安徽科技学院 食品工程学院， 安徽 凤阳　233100)

蓝莓,又称蓝浆果、越橘,属杜鹃花科，含有大量的天然色素，果实中的花青素和超氧化歧化酶的含量普遍高于其他植物[1-2]。我国有丰富的野生蓝莓资源，蓝莓饮料行业正是利用这一优势，对蓝莓果实进行初级的加工，充分利用蓝莓果实营养价值。蓝莓渣为蓝莓取汁后剩余的废料，其中含有较多的花青素和膳食纤维，具有很高的利用价值[3-5]。花青素(Anthocyanin)是水溶性的植物色素，是黄酮类代谢途径的分支产物。游离状态的花青素在自然状态下极为少见，同时花青素的提取也十分困难，主要以糖苷形式存在，花青素是一种小分子物质容易被人体吸收利用。保加利亚乳杆菌，属于乳酸杆菌，因其菌种产地、微生物特性、效能优异等特点，被微生物学家命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种[6-7]。花青素(Anthocyanin)是水溶性的植物色素，是黄酮类代谢途径的分支产物。游离状态的花青素在自然状态下极为少见，同时花青素的提取也十分困难，主要以糖苷形式存在，花青素是一种小分子物质容易被人体吸收利用。发酵过程中所产生的乳酸，可以促进胃内容物排空，减少胃酸的分泌，有助于钙、铁、磷的利用率，抑制胃肠道中的有害细菌，促进肠道的健康[8-9]。同时，乳酸菌及其代谢产物，例如多糖、有机酸和乳链球菌胎等产物有助于改善人体的免疫力，调节胃肠道生态环境防止致病菌的侵入。乳酸菌饮料通常是以脱脂奶粉或牛乳为原料，配以果蔬、糖类、植物蛋白为辅料通过发酵制得的一种发酵型的酸性含乳饮料[10-11]。本研究是利用蓝莓渣中添加保加利亚乳杆菌进行发酵，开发出一种富含花青素及乳酸菌的保健型活菌发酵饮料。

1　材料与方法

1.1　实验材料

蓝莓渣粉(安徽科技学院食品工程学院实验室)；伊利高蛋白脱脂高钙奶粉(伊利乳业有限责任公司)；食用葡萄糖(AR,国药集团)；MRS固体培养基(青岛海博生物科技有限公司)。菌种：德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌GDMCC 1.155。HI98103 pH计(上海希庆电子科技有限公司)；DHG-9101-3SA型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)；NGP-9050隔水式恒温培养箱(金坛市晶玻实验仪器厂)；HH数显恒温水浴锅(金坛市全程国胜实验仪器厂)；722型分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；XW-80A漩涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；自动高压灭菌锅165/8Z(宁波久兴医疗器械有限公司)。

1.2　实验方法

1.2.1基本操作要点将蓝莓渣粉、脱脂奶粉和食用葡萄糖按一定的比例混合。采用巴氏杀菌法(在62～65 ℃的温度下灭菌30 min)以最大程度的保留蓝莓渣粉中花青素的含量。经灭菌后的待发酵液冷却至室温，将37 ℃ 培养活化后的德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌按照一定比例接种。经过一定时间发酵后，进行低速离心(1 000 r/min离心5 min)，去除发酵液中的蓝莓渣，进行均质，制得发酵乳饮料成品。

1.2.2检测指标及方法活菌数的测定采用平板菌落计数法，在无菌状态下吸取1 mL的样液加入到9 mL灭菌且冷却的生理盐水中，进行10倍梯度稀释，取1 mL适当梯度的稀释液涂布于MRS固体培养，42 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，每个样品做3次重复[12]。

利用pH计测定样品的pH值，每个样品做3次重复。

采用双波长pH值示差法测定样品中花青素的含量[13]。该方法以矢车菊3-葡萄糖苷为参照，取1 mL样品分别用pH=7.0的缓冲液和pH=4.5的缓冲液定容至10 mL，放置20 min，之后在510 nm和700 nm波长下测定吸光值[14]，代入公式中：

花青素含量(mg/ml))=(A×MW×DF×V)/(E×1)

A=(A510 nm-A700 nm)pH1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5；矢车菊3-葡萄糖苷的相对分子质量MW449.2；稀释倍数DF10；E，矢车菊3-葡萄糖苷的摩尔消光系数26 900；1，比色皿的光段长度；蓝莓汁的体积或提取液的总体积V(mL)。

1.2.3脱脂奶粉对发酵乳饮料品质的影响配料时，脱脂奶粉的添加量分别为0%、5%、10%、15%、20%和25%。蓝莓渣的添加量为0.5%，食用葡萄糖的添加量为4%，接种量为0.1%，培养时间为20 h，培养温度为37 ℃，根据发酵乳饮料中活菌含量、pH值及花青素含量确定最佳脱脂奶粉添加量。

1.2.4葡萄糖对发酵乳饮料品质的影响配料时，食用葡萄糖的添加量分别为0%、3%、6%、9%和12%。蓝莓渣的添加量为0.5%，脱脂奶粉的添加量为10%，接种量为0.1%，培养时间为20 h，培养温度为37 ℃。根据发酵乳饮料中活菌含量、pH值及花青素含量确定最佳食用葡萄糖添加量。

1.2.5蓝莓渣对发酵乳饮料品质的影响配料时，蓝莓渣的添加量分别为0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1%。脱脂奶粉的添加量为10%，食用葡萄糖的添加量为9%，接种量为0.1%，培养时间为20 h，培养温度为37 ℃。根据发酵乳饮料中活菌含量、pH值及花青素含量确定最佳蓝莓渣添加量。

1.2.6接种量对发酵乳饮料品质的影响配料时，接种量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%。脱脂奶粉的添加量为10%,蓝莓渣的添加量为0.4%，食用葡萄糖的添加量为9%，培养时间为20 h，培养温度为37 ℃，根据发酵乳饮料中活菌含量、pH值及花青素含量确定最佳接种量。

1.2.7发酵温度对发酵乳饮料品质的影响培养温度分别取35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃和45 ℃。脱脂奶粉的添加量为10%,蓝莓渣的添加量为0.4%，食用葡萄糖的添加量为9%，接种量为0.2%，培养时间为20 h，根据发酵乳饮料中活菌含量、pH值及花青素含量确定最佳发酵温度。

1.2.8发酵时间对发酵乳饮料品质的影响培养时间分别取18、20、22、24和26 h。脱脂奶粉的添加量为10%,蓝莓渣的添加量为0.4%，食用葡萄糖的添加量为9%，接种量为0.2%，培养温度为37 ℃，根据发酵乳饮料中活菌含量、pH值及花青素含量确定最佳发酵时间。

1.2.9正交实验在单因素试验基础上以及对保加利亚乳杆菌生长的主要限制性因素考虑，选择脱脂奶粉的添加量、食用葡萄糖添加量、菌种的接种量、发酵时间4个因素为主要研究对象，设计5因素4水平的正交实验，以活菌数含量、pH值及花青素含量为指标选出最佳工艺条件。因素水平编码表见表1。

表1　正交实验因素水平表

1.2.10数据处理与统计分析每个试验均重复 3 次，数据表示以平均值±标准差形式表示，通过SPSS 16.0软件和Origin 9.1软件分析，方差分析的显著性水平P=0. 05。

2　结果与分析

2.1　脱脂奶粉对蓝莓渣发酵饮料品质的影响

由图1可以看出脱脂奶粉添加量与蓝莓渣发酵饮料的菌落数和pH值呈正相关关系，随着脱脂奶粉添加量的增加菌落数和pH值在逐渐上升，当添加量达到10%时，两个指标的上升率有所减缓；样品中的花青素最高，达到0.524±0.057 mg/mL。根据蓝莓渣乳酸活菌饮料的特点，需保持较高的活菌数及花青素含量，且低pH值可以保证乳饮料有较长的保存期，综述分析，确定脱脂奶粉的添加量为10%。

2.2　葡萄糖对蓝莓渣发酵饮料品质的影响

由图2所示葡萄糖添加量，对pH值和花青素含量的影响无明显线性关系，而且波动范围较窄；当葡萄糖的添加量为9%时，蓝莓渣发酵饮料中活菌数最高，其对数值达到10.18±0.02 lgCFU/mL。综上考虑，选取9%的葡萄糖为最适添加量。

2.3　蓝莓渣对蓝莓渣发酵饮料品质的影响

由图3可知，随着蓝莓渣添加量增加，样品中花青素含量不断提高，pH值不断下降；当蓝莓渣添加量为0.4%时，蓝莓渣发酵饮料中的活菌数最高，达到10.055±0.025 lgCFU/mL，之后开始下降。保加利亚乳杆菌的最适生长pH为5.0～6.2，在pH为3.0～4.5时亦能生长，所以当蓝莓渣添加量过高时，保加利亚乳杆菌的生长受到限制。综合考虑成本与样品品质等因素，选择0.4%的蓝莓渣添加量最为适宜。

图3　蓝莓果渣对蓝莓果渣发酵饮料活菌数、pH值和花青素含量的影响

2.4　接种量对蓝莓渣发酵饮料品质的影响

根据接种量的不同，以花青素含量、活菌数和pH值为指标，测得其对蓝莓渣发酵饮料的影响，结果见图4。菌种接种量的不同对发酵有一定影响，接种量过多，会影响发酵液溶氧不足，最终会影响产物的生成，过少则会导致发酵时间的延长，不利于提高产品的生产率。当接种量为0.5%的时候活菌数最高；且此时的花青素含量也较高，达到0.342±0.036 mg/mL；此条件下的pH值，更适宜保加利亚乳杆菌的生长，口感也较为适中。

图4　接种量对蓝莓渣发酵饮料活菌数、pH值和花青素含量的影响

2.5　发酵温度对蓝莓渣发酵饮料品质的影响

根据温度的不同，以活菌数和pH值为指标，测得其对蓝莓渣发酵饮料的影响(图5)。保加利亚乳杆菌的适宜的生长温度为40～45 ℃，50 ℃亦能生长，25～35 ℃生长不良，15 ℃停止发育，由图10可知当温度在43 ℃时，保加利亚乳杆菌的生长状况均高于其他发酵温度。此温度下的发酵产品pH值仅高于35 ℃和37 ℃下的pH值相差较小，相比较该发酵温度获得的花青素含量较低，且适当的温度下会缩短发酵的时间，故选43 ℃为最佳发酵温度。

图5　发酵温度对蓝莓渣发酵饮料活菌数、pH值和花青素含量的影响

2.6　发酵时间对蓝莓渣发酵饮料品质的影响

根据发酵时间的不同，以活菌数和pH值为指标，测得其对蓝莓渣发酵饮料的影响，由图6所示，发酵时间过长会导致乳酸大量产生，降低产品的口感，且过长的发酵时间会导致资源浪费，不利于产品利益化；发酵时间过短，饮料的风味无法完全散发出来，影响口味和饮料中的活菌数。当发酵时间在24 h时活菌数仅低于发酵时间为15 h，但15 h时产品的pH值相对较高，不利于胃肠道环境的稳态，而24 h的pH值时试验组中最低的，较为适宜，且考虑到发酵成本和其风味的影响因此选取24 h为培养时间。此时活菌数达到9.36 lgcfu/mL，pH值为3.67。

图6　发酵时间对蓝莓渣发酵饮料活菌数、pH值和花青素含量的影响

2.7　正交实验结果

在单因素实验基础上，以脱脂奶粉添加量(A)、葡萄糖添加量(B)、接种量(C)，发酵时间(D)，空列(E)进行L16(45)正交实验分析，通过活菌数(40%)、pH值(20%)和花青素含量(40%)等指标综合分析，确定蓝莓渣发酵饮料的最佳工艺条件。由正交实验和极差分析(表2)，可知四个因素对产品中活菌数的影响顺序分别为：脱脂奶粉添加量(A)>葡萄糖添加量(B)>发酵时间(D)>空列(E)>接种量(C)。由方差分析(表3)可得，因素A显著(P<0.05)，因素B、C、D、E相对于产品中活菌数指标均不显著。

由表2极差分析，根据以上三指标的比例分配，获得的最优组合(A4B4C2D3)与试验组活菌数最高组合(A4B3C4D2)、pH值最高组合(A1B4C4D4)和花青素含量最高组合(A1B1C1D1)均不一致，进行验证实验，每组3个重复。通过比较分析(表4)，由A4B4C2D3组合得到产品，其活菌数和花青素含量较高，产品中的pH较低。此时的产品风味好，色泽浅，活菌数可以最大化保留，营养价值较高。

表2　正交实验结果

通过活菌数、pH值和花青素含量的方差分析可知脱脂奶粉的添加量对蓝莓渣发酵饮料的各个影响均为显著，食用葡萄糖、接种量、培养时间对实验结果的影响均不显著。

表3　正交实验方差分析表

注:* 表示差异显著(P<0. 05)。

表4　pH值的方差分析

注:* 表示差异显著(P<0. 05)

表5　花青素含量的方差分析

注:* 表示差异显著(P<0. 05)

表6　验证试验结果

3　结论与讨论

通过单因素和正交试验研究了蓝莓渣发酵乳饮料的生产工艺，结果表明：脱脂奶粉添加量20%、食用葡萄糖添加量12%、蓝莓渣添加量0.4%、发酵温度43 ℃、发酵时间24 h和接种量0.5%等条件下得到的蓝莓渣发酵乳饮料其保加利亚乳杆菌菌落数最高，产品中花青素含量最高，而且风味独特，口感适宜，是一种值得开发、极具市场价值的保健发酵乳饮料。