HPLC法同时测定粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素的含量

宋俊蓉 娄华勇 方友来 蓝俊杰 何敏 马小攀 潘卫东

摘 要：基于更好的完善粉防己的質量控制标准，以提取时间、方法、溶剂比为主要影响因素，考察了不同提取方法对粉防己中汉防己甲、乙素提取率的影响，建立了一种同时测定粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素的高效液相色谱分析方法。色谱条件为：Hypersil GOLD Phenyi柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm），甲醇- 0.1% 三乙胺 （85∶15），检测波长为228 nm，进样量10μL，柱温30℃，流速1 mL/min。样品中汉防己甲素在0.12～2.31 μg范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为102.80%、104.46%、103.49%，RSD分别为1.72%、0.38%、1.39%；汉防己乙素在0.05～1.09 μg范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为101.00%、100.08%、100.00%，RSD分别为0.40%、1.82%、1.83%。结果表明江西的粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素含量高于其他产地。上述测定方法操作便捷、重现性好、结果可靠。

关键词：高效液相色谱法；粉防己；汉防己甲素；汉防己乙素；同时测定

中图分类号：O656.22

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）03-0079-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.014

Simultaneous Determination of Tetrandrine and Fangchinoline from Stephania tetrandra by HPLC

SONG Junrong1，2， LOU Huayong2， FANG Youlai1，2， LAN Junjie1，2， HE Min2， MA Xiaopan3， PAN Weidong2*

（1. School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550002， China； 2. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang， Guizhou 550014， China； 3. Zunyi Medical University， Zunyi， Guizhou 563000， China）

Abstract： In order to Improve the quality control standard of Stephania tetrandra， establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneously determination the content of Tetrandrine and Fangchinoline in S. tetrandra，was established. The effects of different extraction methods， the extraction time， method， and solvent ratio in particular， on the extraction rate of Tetrandrine and Fangchinoline were investigated. The conditions of HPLC were as below： Hypersil GOLD Phenyi column （250 mm ×4.6 mm， 5μm）， and a mobile phase consisted of methanol and 0.1% triethylamine （85∶15） by gradient elution at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was 228 nm and sample volume was 10 μL. The sample showed a good linear relationship with tetrandrine in the range of 0.12～2.31 μg. The mean sample recovery was 102.80%， 104.46%， and 103.49%， respectively， and the RSD was 1.72%， 0.38%， and 1.39%， respectively. The sample showed a linear relationship with Fangchinoline in the range of 0.05～1.09 μg. The average sample recovery rate was 101.00%， 99.08%， and 100.00%， respectively. The RSD was 0.40%， 1.8% and 0.40%， respectively. The above HPLC conditions were used to determine the contents of tetrandrine and Fangchinoline in S. tetrandra of different origins. The results showed that the contents of tetrandrine and Fangchinoline in S. tetrandra from Jiangxi Province were higher than those from other origins. The method described in the present study appears to be convenient， reproducible and reliable.

Key words：HPLC； Stephania tetrandra； tetrandrine； fangchinoline； simultaneous determination

粉防己（Stephania tetrandra S.Moore），又名汉防己、土防己、石蟾蜍、猪大肠等，为防己科植物千金藤属植物粉防己的干燥块根[1]，味苦辛，性寒，归膀胱、肺经，具有解热镇痛、利水消肿，祛风止痛等功效[2]，用于水肿脚气、小便不利、风湿痹痛、湿疹疮毒、高血压等症的治疗。粉防己中生物碱含量占总含量的1.5%～2.3% [3]，以双苄基异喹啉类生物碱为主 [4]，主要为汉防己甲素（Tetrandrine， 简称Tet）和汉防己乙素（Fangchinoline，简称Fan）。现代药理学证明粉防己中的生物碱具有良好的生物活性，在抗肝纤维化、拮抗Ca2+治疗高血压、诱导肿瘤细胞凋亡等方面都有较好的效果[5-6]，汉防己乙素亦可诱导肝癌细胞的自噬性死亡[7]。从粉防己药材中提取、分离、纯化出来的双苄基异喹啉生物碱汉防己甲素已应用于临床。

目前，粉防己药材的获取方式主要以采挖野生为主，由于野生植物资源日益萎缩，所以野生粉防己不能满足市场需求，且人工种植粉防己周期长、品质差，致使市场上粉防己品质参差不齐、伪品众多，而其常规的质控方法又不能满足要求[8]。因此，快速测定粉防己中汉防己甲素、汉防己乙素含量的方法亟待建立。

常规的测定粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素的方法有薄层扫描法[9]、薄层色谱法和高效液相色谱法[10-12]，其中，薄层扫描法较复杂，而薄层色谱法无法定量，且经常用到有毒溶剂。高效液相色谱（high performance liquid chromatogram，HPLC）法因处理样品简单、快速，且能同时测定几种成分而被广泛应用于各类化合物的检测。2015版《中国药典》采用HPLC法检测汉防己甲素和汉防己乙素的含量，以乙腈-甲醇-水-冰醋酸（40∶30∶30∶1）（每100 ml含十二烷基磺酸钠0.41 g）为流动相 [13]，其流动相组成较为复杂，溶剂消耗较大，迄今为止，同时测定汉防己甲素和汉防己乙素的HPLC方法还未被中国药典收录。鉴于此，本文建立了一种同时测定粉防己药材中汉防己甲素和汉防己乙素含量的HPLC方法，该法简便、快速，且流动相组成较为简单，容易配制，溶剂消耗较少，为完善粉防己药材的質量控制方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent高效液相色谱系统（G1311A泵、G1315A DVD检测器、Agilent色谱工作站）（1100，American），HP紫外分光光度测定仪（HP-1200，American），SG5200H超声波清洗仪，梅特勒-托利多AL204电子天平，Buchi旋转蒸发仪（B-480，Swiss）。甲醇为色谱纯，二乙胺、三乙胺为分析纯，三级水为Merck Millipore纯水仪自制，对照品汉防己甲素购于南京景竹生物科技有限公司（JZ20150720），汉防己乙素购于成都瑞芬恩生物科技有限公司（F-006-130421），样品粉防己购于多个中药材市场，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为粉防己（Stephania tetrandra S.Moore）的根。

1.2 方法

1.2.1 提取方法优选

将干燥粉防己根粉碎，过3号筛，准确称取8份粉防己药材粉末样品各1 g，分别置于100 mL的具塞锥形瓶中，密塞，分别加入100%、90%、85%、80%、70%甲醇溶液，20%、10%、5%氨水甲醇系列溶液作为提取溶剂进行超声（功率300W，频率40kHz，1 h）及回流提取（1 h），过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液减压蒸干，备用。优选出最佳提取溶剂及提取方法后，准确称取4份粉防己药材粉末样品各1 g，分别置于100 mL的具塞锥形瓶中，密塞，加入85%甲醇溶液，分别超声提取15 min、30 min、60 min和90 min（功率300W），考察提取时间对汉防己甲素、汉防己乙素含量的影响。

1.2.2 供试品溶液的制备

准确称取干燥的粉防己药材粉末（过3号筛）1 g，置于100 mL的具塞锥形瓶中，密塞，加入50 mL 85%甲醇超声30 min，过滤，滤渣超声30 min，合并滤液减压蒸干，加入适量85%甲醇溶解，定容至50 mL的容量瓶中。用0.45 μm的有机微孔滤膜过滤，弃去初滤液，即为供试品溶液。

1.2.3 对照品溶液的制备

分别准确称取经P2O5干燥的汉防己甲素对照品5.78 mg、汉防己乙素对照品2.72 mg，用85%甲醇溶解，定容于50 mL的容量瓶中。配制成汉防己甲素浓度为115.6 μg/mL，汉防己乙素的浓度为54.4 μg/mL的混合对照品溶液，备用。

1.2.4 阴性对照溶液的制备

以85%甲醇作为空白溶液。

1.2.5 色谱条件

测定波长选择：通过对阳性对照品在波长为200～400 nm范围内进行扫描，选取检测波长。

流动相选择：分别考察了乙腈-甲醇-水-冰醋酸（40∶30∶30∶1）（每100 ml含十二烷基磺酸钠0.41g）、甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%三乙胺（85∶15）、乙腈-0.1%三乙胺（85∶15）、甲醇-0.1%二乙胺（85∶15）、乙腈-0.1%二乙胺（85∶15） 6种流动相体系。

1.2.6 线性关系

精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按已优化的色谱条件，注入高效液相色谱仪中，重复测定3次，对其色谱峰面积进行积分，制备标准曲线，得出回归方程。

1.2.7 方法学考察

专属性：分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10μL，按已优化的色谱条件下进样分析。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10 μL，按已优化的色谱条件，注入高效液相色谱仪中，平行测定6次，记录其峰面积，计算其RSD值。

稳定性考察：取同一供试品溶液，在室温中放置，分别于0、1、2、4、8、12、24 h取10 μL按已优化色谱条件测定其峰面积，计算其RSD值。

重复性试验：取同一批药材粉防己5份，准确称取1 g，按“1.2.2”方法制备，按已优化的色谱条件下注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积，计算其RSD值。

加样回收率试验：精密称取汉防己甲素、乙素对照品适量置于10 mL容量瓶中，用85%甲醇溶解并定容， 摇匀，配制成汉防己甲素的浓度为3.100 μg/mL，汉防己乙素为0.658 μg/mL。精密称定已知含量的粉防己粉末0.5000 g，再分别加入已制备好的对照品溶液1.2、1.0、0.8 mL，制成高、中、低浓度的加样回收实验。吸取10μL，按已优化的色谱条件下注入高效液相色谱仪中，记录其峰面积，计算回收率及其RSD值。

1.2.7 含量测定

分别取产地为江西吉安、江西宜春、湖北黄石、安徽铜陵、安徽芜湖的粉防己药材打粉，准确称定粉防己粉末约1 g，按“1.2.2”供试品溶液方法制备，分别吸取10 μL进样，按已优化的色谱条件注入高效液相色谱仪，重复测定3次，外标法计算汉防己甲素和汉防己乙素的含量。

2 结果与分析

2.1 提取方法、溶剂及时间的优化

不同提取方法、不同提取溶剂对粉防己中汉防己甲、乙素提取率的影响如表1、2所示。表1结果表明，超声波提取法的不同溶剂汉防己甲、乙素的提出率均高于连续回流法，随着甲醇体积分数的增加，粉防己中汉防己甲、乙素的得率均呈上升趋势，当甲醇体积分数为85%时，汉防己甲、乙素得率均最高，分别为2.589%和1.129%，明显高于纯甲醇提取和甲醇氨水混合溶剂，故选取体积分数为85%的甲醇溶液作为最佳提取溶剂。说明在此溶液体系下，汉防己甲、乙素在85%甲醇溶液中的溶出度最高。因为当甲醇浓度升高时，溶入有机溶剂的汉防己甲、乙素的量也越多，但当浓度升高至超过最适浓度时，汉防己甲、乙素的溶出度反而降低，从而影响了甲、乙素的提取率，使得提取率隨着浓度的升高而下降。同时，由表1 可知，超声提取所得汉防己甲、乙素的提取率高于回流提取法。因为超声波具有空化效应、机械效应及热效应的特点，这些作用增大了介质分子的运动速度，提高了介质的穿透能力，促进了药物有效成分的溶解及扩散，提高溶出效率。故此选择超声提取法为最佳提取方法。

不同提取时间对汉防己甲、乙素提取率影响结果见表2，由表知，超声提取15 min后汉防己甲、乙素提取率分别为2.516%，1.109%，超声提取30 min后汉防己甲、乙素提取率分别为2.589%，1.129%，分别相差 0.073%、0.020%。超声提取60 min后汉防己甲、乙素提取率分别为2.593%，1.135%，与30 min相比分别相差 0.004%、0.006%。超声提取90 min后汉防己甲、乙素提取率分别为2.596%，1.138%，与30 min相比分别相差 0.007%、0.009%。由此可以看出，超声时间越长提取率越高。其中，超声30 min与超声60 min，90 min所得提取率差别不大，考虑到节约时间，故选择超声提取时间为30 min。

2.2 色谱条件

检测波长：通过对阳性对照品在波长为200 400 nm范围内进行扫描，发现汉防己甲素的最大吸收波长为282 nm，而汉防己乙素的最大吸收波长为228 nm和215 nm处有吸收；又将混合对照品溶液进行相同条件扫描，发现两者的最大吸收波长为228 nm，综合考虑基线平稳，色谱峰峰形，最大吸收等因素，故选择228 nm作为检测波长。

流动相：通过对6种流动相进行考察，结果表明，甲醇-0.1%的三乙胺（85∶15）作为流动相时所得峰形较好，没有拖尾现象，分离效果也较理想，与药典中采用常规HPLC相比分析时间明显缩短，且药材中其他色谱峰不干扰样品的测定，本试验所采用的流动相条件与药典所提供的条件相比较更为简单，容易配制。

色谱柱：由于SinoChrom C8和BDS Hypersil C18色谱柱拖尾较为严重，实验结果都不理想。故本研究选用Thermo， Hypersil GOLD Phenyi的色谱柱，该类型色谱柱具有耐酸、耐碱，峰形、分离度较好，稳定性高等优点。

综上所述，色谱条件为：Hypersil GOLD Phenyi柱， （250 mm × 4.6 mm， 5 μm），甲醇- 0.1% 三乙胺（85∶15），检测波长为228 nm，进样量10μl，柱温30℃，流速1 mL/min。

2.3 线性分析

以色谱峰面积A为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程分别为：汉防己甲素：Y=2951.9X-29.297（r=0.9999）；汉防己乙素：Y=5509.9X+43.226（r=0.9997）。结果表明，汉防己甲素和汉防己乙素分别在0.12～2.31 μg和0.05～1.09 μg范围内与峰面积之间呈良好的线性关系。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

从图1可知，汉防己甲素和汉防己乙素在此条件下可实现较好的分离，且阴性对照无干扰，表明该方法专属性良好。同时，出峰时间较短，表明该方法较为快捷，溶剂消耗比较少。

2.4.2 精密度试验 由峰面积计算出汉防己甲素和汉防己乙素的RSD值分别为0.82%和0.31%。表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性考察 由峰面积计算出汉防己甲素和汉防己乙素的RSD值分别为0.83%和0.80%，结果表明供试品溶液在24h內稳定。

2.4.4 重复性试验 由峰面积计算出汉防己甲素和汉防己乙素的RSD值分别为0.74%和0.98%，结果表明汉防己甲素和汉防己乙素的重复性较好。

2.4.5 加样回收率试验 所得回收率、平均回收率、RSD结果见表3和表4。

2.4 含量测定

不同产地粉防己中汉防己甲、乙素含量测定见表5，江西吉安的汉防己甲素含量最高，为2.654%，安徽铜陵的含量最低，为1.764%，江西宜春的汉防己乙素含量最高，为1.731%，安徽铜陵的含量最低，为1.604%。，江西的粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素含量高于其他产地。

3 结论与讨论

通过对不同提取方法、提取时间及提取溶剂的优化选择，以及对不同流动相、不同色谱柱等方法和条件的实验摸索和验证，确定了高效、经济的HPLC色谱条件来同时测定生药粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素含量的方法，即：用85%甲醇超声提取30 min，以甲醇- 0.1%三乙胺（85∶15） 为流动相，色谱柱为Thermo， Hypersil GOLD Phenyi， Dim.（250×4.6 mm）， 检测波长为228 nm，进样量10 μL，柱温30℃，流速1 mL/min。利用上述HPLC条件测定了不同产地粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素的含量，结果表明江西的粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素含量高于其他产地。从实验结果可知，该方法操作便捷、重现性好、专属性强，精密度、重复性、稳定性良好，适合用于汉防己甲素和汉防己乙素的含量测定。

参 考 文 献：

[1] 陈修园.神农本草经读[M].北京：学苑出版社，2012：74.

[2] 黄丽萍，左 坚，张 颖.不同产地粉防己药材中主要生物碱含量对比研究[J].甘肃中医学院学报，2010，10（3）：65-67.

[3] 边 城， 庞统英， 戴素美， 等.汉防己甲素抗肝纤维化作用研究[J].山东医药，2004，44（34）：24-25.

[4] 崔文峰， 鲍 玲， 周 英，等.一种提取粉防己碱的新方法[J].天然产物研究与开发，2008，20（4）：701-703.

[5] 李行诺， 果德安.粉防己生物碱化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报，2009，26（6）：430-433.