HPLC法同时测定烟叶中6种多酚类物质

张启发 聂琼 邹序生 谢瑞 刘云鹤

摘 要：本文建立了一种可同时测定烤烟叶片中绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的高效液相色谱（HPLC）检测方法，并分析了不同烟草杂种F1及其亲本中上述多酚的含量。采用甲醇：水=7∶3为提取液，超声提取30 min，色谱柱为Agilent 5 TC-C18 （250 mm × 4.6 mm，5 μm） ；2%冰乙酸水溶液-甲醇为流动相，梯度洗脱，流速1 ml/min；柱温30℃；进样体积10 μl。结果显示：6种多酚类物质分离效果良好，加样回收率范围在95.53%～100.622%（RSD为0.95%～2.285%），稳定性RSD（n=3）为0.13%～1.73%。绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的线性范围在10～600 μg/ml之间，各多酚类物质线性方程相关系数在0.99996～0.99999之间。各材料的绿原酸和芦丁含量较高，为多酚类物质主要成分，其他多酚物质含量则比较低。杂种F1相对其亲本材料在某种多酚含量中表现出一定优势，VA116 × GDH88绿原酸含量远远高于其两个亲本材料，VA116 × TN90芦丁含量也超越其双亲，而绿原酸含量则低于其亲本VA116，Florida301 × GDH94芦丁含量超越雙亲，绿原酸含量则低于其亲本GDH94。

关键词：烤烟；HPLC；多酚；绿原酸；芦丁

中图分类号：S572

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）03-0021-06 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.004

Simultaneous Determination of Six Polyphenols in Flue-cured Tobacco Leaves by HPLC Method

ZHANG Qifa1，2，NIE Qiong1，2*，ZOU Xushen1，2，XIE Rui1，2，LIU Yunhe1，2

（1. College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China；2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Tobacco Quality，Tobacco Research Center of Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was developed for the simultaneous determination of chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， palatalin， quercetin， and kaempferol in flue-cured tobacco leaves. The content of these six polyphenols were analysed in the hybrid F1 and its parents for different tobaccos. The extraction solution of pure methanol：pure water =7：3 was used. Ultrasonic extraction was performed for 30min. Column T was Agilent 5 TC-C18 （250mmx4.6mm， 5 mm）. Two per cent of aqueous glacial acetic acid-methanol was used as the mobile phase. Gradient elution with the flow rate of 1ml/min was applied. Column temperature was at 30 C and injection volume was 10 L. The results showed that the six polyphenols had good separation effect. The rate of recovery ranged from 95.53% to 100.622% （RSD was 0.95% to 2.285%）， and the stability RSD （n=3） was 0.13% ～ 1.73%. Chlorogenic acid， caffeic acid， rutin， palatalin， quercetin and kaempferol was in the range of 10～600 g/ml. The correlation coefficients of the linear equation of polyphenols varied from 0.99996 to 0.99999. The content of chlorogenic acid and rutin in each material was relatively high， which was the main component of polyphenols. The content of other polyphenols is relatively low. Hybrid F1 had some advantages relative to its parent materials in certain polyphenol contents. For example， the content of chlorogenic acid of VA116 X GDH88 in hybrid F1 was much higher than that of its two parent materials； the content of rutin of VA116 X TN90 also surpassed the parents； while the content of chlorogenic acid was lower than that of its parent VA116； the content of rutin of Florda301 X GDH94 was also beyond that of the parents， while the content of chlorogenic acid was lower than that of its parent GDH94.

Key words：Tobacco polyphenols；HPLC；chlorogenic acid；rutin；method validation

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种以吸食为主要目的的特殊经济作物，其香味基本上决定了它的利用价值或可用性[1]。多酚类化合物是烟草的重要潜香物质，烤烟中多酚含量可达7%；芸香苷、绿原酸和莨菪亭是烟叶中最丰富的多酚，不仅对烟叶颜色有直接作用，而且对烟气质量和香气有间接作用，可赋予烟气清甜香、烤香[2]。 一般认为，烤烟中多酚类物质的含量与烟叶品质、芳香吃味是一致的。多酚类物质含量越高，烟草制品等级也就越高[3]。多酚类物质主要存在于叶片中，茎和根部有少量积累[4]。庄亚东等[5]对烟草多酚类化合物研究发现：多酚化合物对烟株的生长发育、抗病虫害、抗逆性有很大影响。韩景峰等[6]研究发现：鲜烟叶中多酚与烟叶的易烤性也有很大关系。因此，测定分析烟草中多酚类物质的含量，可为优质烟草品种的筛选、选育提供数据支撑。

HPLC法分析烟草中的多酚物质，具有分离高效，测定准确的优点。目前已有HPLC法鉴定烟叶中绿原酸、芦丁、莨菪亭等多酚物质的相关报道[6-7] ，但还没有同时测定烟叶中绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的相关报道。超声提取法是通过空化作用、热效应、机械作用使植物组织内部的温度瞬时升高，加速目标成分的溶出[8-9]。超声提取法具有效率高，不用加热，可大大缩短提取时间，不会导致多酚类物质的分解等优点而得到广泛推广应用[8，10]。因此，本文拟采用Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，优化样品提取法，建立适用于烟草样品中绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素等多种多酚物质同时分析的方法，并在此基础上分析几个烟草品种（系）及其杂种F1的多酚类物质，以期为筛选高多酚含量的烟草品种（系）和了解多酚物质性状杂种优势现象提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 引进品种VA116、Florida301和TN90，贵州大学自育烤烟品系GDH94和GDH88，杂种F1：GDH88×VA116，VA116 ×TN90，Florda301 × GDH94，上述材料烤后C2F烟叶。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：绿原酸、咖啡酸、芸香苷、莨菪亭、槲皮素标准品均购自上海金穗生物科技有限公司；色谱纯甲醇、分析纯甲醇、乙酸购自贵州赛兰博科技有限公司；水为娃哈哈纯净水。

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪； Agilent5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；台式超声清洗器PS-20；赛多利斯万分之一电子天平。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的优化

色谱条件参照夏雅俊[10]建立的HPLC 法同时测定油橄榄叶中的 5 种多酚类化合物含量条件。流动相A为娃哈哈纯净水（加入2%的冰乙酸），流动相B为色谱纯甲醇；流动相梯度为：0 min A∶B=80∶20；25 min A∶B=50∶50；35 min A∶B=0∶100；45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱温：30℃；进样体积：10 μl；检测波长100～600 nm。

1.2.2 标准溶液的配制

分别称取4.8 mg绿原酸、4.9 mg芸香苷、4.8 mg咖啡酸、5.0 mg莨菪亭、4.8 mg山奈酚标准对照品，用70%的甲醇溶液溶解，定容至100 ml，分别配制成48 μg/ml绿原酸、49 μg/ml芸香苷、48 μg/ml咖啡酸、50 μg/ml莨菪亭及48 μg/ml山奈酚標样溶液母液，备用。分别移取标样母液1、2、3、5、10 ml，以70%的甲醇稀释配成不同浓度的系列标样溶液，经0.45 μm的滤膜过滤待用。

1.2.3 线性关系和检测限考察

将1.2.2所配置一系列不同浓度的绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚标准溶液用1.2.1的色谱条件进样分析，进样量为10 μl，进样次数为2。以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制标准曲线进行线性分析，得到各物质的回归方程和相关系数。通过稀释混合标准溶液测定每种多酚物质的检出限（信噪比S/N=3）和定量限（信噪比S/N=10），线性范围参照《JJG-705-2002-液相色谱仪检定规程》[12]中的方法进行确定。

1.2.4 稳定性考察

取一定质量浓度的6种多酚类物质标准溶液和供试样品于温室放置，分别在0、2、4、6、8、10、24、48 h，按照相同的色谱条件进样分析，计算相对标准偏差。

1.2.5 样品提取条件的优化

以GDH94旺长期中部杀青叶片为材料，采用单因素实验优化烟叶中粗多酚的最佳提取条件。取烟草叶片粉末1 g，于100 ml容量瓶中，分别用娃哈哈纯净水配制纯甲醇、95%甲醇、90%甲醇、85%甲醇、80%甲醇、75%甲醇、70%甲醇65%甲醇和60%甲醇作为提取试剂，超声波清洗器超声提取30 min，冷却后溶液经0.45 μm的滤膜过滤进样测定。然后以量最高的提取液提取样品，进行超声时间的优化，超声时间分别为10、15、20、25、30、35和40 min。

1.2.6 提取回收率和精密度考察

称取两份相同GDH94材料5 g，其中一份加入一定量的标准品，将两样品在相同条件下按照1.2.1的色谱条件进行HPLC分析，进样3次重复试验，通过标曲方程算出各样品浓度，计算出各种多酚类物质的回收率和相对标准偏差（RSD）。

1.2.7 数据采集

在选定分析条件下，采用外标法导出数据进行定量分析。分别采集六种多酚类物质的光谱图和色谱图，及不同比例提取试剂和不同超声时间所检测出的各种多酚类含量进行对比分析。

1.2.8 样品测定 分别称取VA116，GDH88，GDH94，Florda301，TN90，GDH88×VA116，VA116×TN90，Florida301×GDH94的C2F烟叶粉末1.000 g于100 ml容量瓶中，定容。利用优化的方法进行样品测定分析。

2 结果与分析

2.1 6种多酚光谱图及色谱图分析

利用单个标准品按照1.2.1的色谱条件进样，采集光谱信息同时记录保留时间。由图1可以看出：绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素及咖啡酸的紫外吸收集中在200～350 nm之间，且各多酚物质的光谱图特征各有不同。由图2 a可见，以流动相：水（2%的冰乙酸）-甲醇；流动相梯度：0 min A∶B=80∶20，25 min A∶B=50∶50，35 min A∶B=0∶100，45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱温：30℃；进样体积：10 μl的运行体系可以很好的将6种多酚物质给区分开来。与单个标品的保留时间比对，获得各酚类物质的保留时间分别为：绿原酸9.702 min；咖啡酸12.151 min；莨菪亭16.511 min；芦丁23.030 min；槲皮素30.763 min；山奈酚32.807 min。根据不同保留时间和光谱图特征，经过标准品和供试样品进行光谱图比对可以确定供试样品的各个峰所代表的物质（图2b）。

2.2 不同比例提取试剂的影响

由图3可以看出，烟叶中多酚类物质以绿原酸和芦丁含量最高，咖啡酸和山奈酚含量最低。甲醇浓度明显影响多酚类物質的提取效率。95%甲醇提取的绿原酸量比以100%纯甲醇的提取量显著增加，其中绿原酸提取量增加了153%，芦丁提取量增加了46.67%，莨菪亭的提取量增加了188.53%，6种多酚总提取量增加了93.58%。甲醇∶水=70∶30时，烟叶中多酚类物质提取率最高；随着甲醇浓度的降低，提取效果没有明显增加，甚至略有下降。

2.3 不同超声时间对烤烟多酚含量提取的影响

如图4所示，超声萃取时间与提取效果存在一定的关系，随着超声萃取时间延长，提取量有所增加，超声时间30 min时，提取量已基本稳定，超声时间为30 min时，绿原酸提取量比超声时间为10 min时增加了6.01%，芦丁提取量增加了5.80%；莨菪亭提取量增加了0.27%，总含量较超声时间为10 min时增加了5.5%。继续延长超声时间，各多酚物质提取量增加不再明显，采用30 min为超声提取时间。

2.4 线性关系和检测限考察

将1.2.2所配制一系列不同浓度的绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素和山奈酚混合标准品溶液用1.2.1的色谱条件进样分析，绘制标准曲线，得到各物质的回归方程和相关系数（表 1）。通过稀释混合标准溶液测定每种多酚物质的检出限（信噪比S/N=3）和定量限（信噪比S/N=10），线性范围参照《JJG-705-2002-液相色谱仪检定规程》[11]中的方法进行确定。结果表明绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素及山奈酚6个物质的标准曲线相关系数R均大于0.9999；检测限分别为2.51、0.20、5.62、1.19、0.15、0.12 μg/ml，定量限分别为8.38、0.69、16.32、3.64、0.56、0.42 μg/ml，显示该方法具有较高的灵敏度，可对多酚类物质含量较低的样品进行分析。

2.5 提取回收率与精密度实验

称取两份相同材料，按照1.2.3的方法进行回收率和精密度试验结果如由表2所示。由表2可知，6种多酚类物质的加标回收率为95.53%～100.622%，RSD为0.95%～2.285%（n=5），说明所建立的方法重复性好，准确度高。

2.6 稳定性实验

取1.2.5中70%提取超声时间为30 min的供试样品适量，分别在室温下放置0、2、4、6、8、16、24、48 h，按1.2.1色谱条件测定，记录峰面积。计算RSD，结果供试样品绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素、山奈酚RSD分别为1.43%、0.89%、1.65%、1.11%、0.55%、0.79%（n=5），表明供试品室温放置48 h内基本定性。

2.7 供试材料多酚类物质含量检测

表3结果显示不同材料中不同多酚物质含量不同，各材料的绿原酸和芦丁含量较高，其他多酚物质含量较低；其中GDH88×VA116中多酚类物质总含量最高，达14.51mg/g，绿原酸含量（11.74mg/g）也显著高于其他材料。TN90的多酚类物质总含量、绿原酸和芦丁的含量都最低。各杂交种相对其亲本材料在某种多酚含量中都有一定优势，如GDH88×VA116在绿原酸含量上远远高于其两个亲本；VA116 × TN90在芦丁含量上也超越其双亲，而绿原酸含量则低于其亲本VA116；Florda301 × GDH94在芦丁含量上也超越了双亲，在绿原酸含量上则低于其亲本GDH94。

3 结论与讨论

本文通过对提取试剂、超声时间的优化，建立了同时检测烟草多酚类物质绿原酸、咖啡酸、芦丁、莨菪亭、槲皮素及山奈酚的高效液相色谱法：流动相A为娃哈哈纯净水（加入2%的冰乙酸），流动相B为色谱纯甲醇；流动相梯度为：0 min A∶B=80∶20；25 min A∶B=50∶50；35 min A∶B=0∶100；45 min A∶B=0∶100；流速：1 ml/min；柱温：30℃；进样体积：10 μl；检测波长100～600 nm。提取试剂选择70%的甲醇，超声时间为30 min。

验证表明：应用该方法检测的标准曲线相关性非常好，相关系数为0.99996～0.99999，回收率95.53%～100.622%的范围，说明方法准确可信；变异系数低于2%，说明方法重现性好；稳定性试验RSD在0.55%～1.43%之间，说明所采用提取方法提取的6种多酚类物质比较稳定。所优化的方法可以用于高效液相色谱法检测烟草叶片中多酚类物质含量。

利用所建立的方法检测了3个杂种F1及其亲本材料的多酚类物质含量，结果表明绿原酸和芦丁是烟叶多酚物质的主要成分，咖啡酸、莨菪亭、槲皮素和山奈酚的含量较低。不同样品之间的绿原酸含量差异较大，在0.25～11.74之间。同一品系不同时期的绿原酸含量也不同，在优化提取试剂时，采用的是GDH94 旺长期的杀青叶片为材料，此时的绿原酸及芦丁的含量都显著低于成熟期烤后烟叶的含量。杂交种相对其亲本材料在某种多酚含量中都有一定优势；GDH88×VA116在绿原酸含量上远远高于其两个亲本材料；VA116 × TN90在芦丁含量上也超越其双亲，而绿原酸含量则低于其亲本VA116；Florda301 × GDH94在芦丁含量上也超越了双亲，在绿原酸含量上则低于其亲本GDH94。

绿原酸是抗菌、抗病毒、抗低血压以及治疗肥胖的有效药理成分之一[12-13]。芦丁也具有抗氧化、消除自由基、保护心脑血管等作用[14]。在医药、化工和食品等领域都具有光明的应用前景。从杂交种的杂种优势表现来看，绿原酸和芦丁都存在较为明显的超亲优势现象，这可能是杂交种中控制苯丙素生物合成途径和黄酮类生物合成途径的单个基因表达或多个基因互作调控引起的。因此，可从基因层面进一步研究、利用杂种优势培育高含量的绿原酸和芦丁的烟草杂交种，拓展烟草的综合利用价值。

参 考 文 献：

[1] 王 彪，李天福，王树会.烟叶香吃味指标的因子分析[J].云南农业大学学报，2006，21（1）：125-126.

[2] 朱大恒，韩锦峰，李彩霞.烤烟发酵过程中品质及香吃味的形成[J].河南农业科学，1997，（3）：5-7.

[3] 朱小茜，徐晓燕，黄义德，等.多酚类物质对烟草品质的影响[J].安徽农业科学，2005，33（8）：1910-1911.

[4] 孟冬玲，李小兰，周 晓.国内主要烟叶产區不同部位的多酚含量分析[J].大众科技，2011，（12）：87-88.

[5] 庄亚东，张 映，王 芳，等.卷烟中多酚类物质的分析[J].烟草科技，2004，（1）：23-26.

[6] 韩景峰，林学梧，黄海棠，等.烟叶成熟过程中一些生理变化的研究[J]. 华北农学报，1991（6）：63-67.

[7] 沈丹红，路 鑫，常玉玮，等.高效液相色谱-紫外/质谱检测法联合测定新鲜烟叶中的25种酚类物质[J].色谱，2014，32（1）：40-46.

[8] 史春云，袁凯龙，肖卫强，等.超高效液相色谱法快速检测烟叶中8 种多酚类化合物.西南农业学报，2015，28（3）：1322-1326.

[9] 何 敏，舒 刚，杨 乐，等.葛根芩连注射剂中3种有效成分的HPLC法测定及其优化[J].河南农业科学，2014，43（6）：152-156.

[10] 夏雅俊，孙小明，张 佳，等.HPLC 法同时测定油橄榄叶中的 5 种多酚类化合物含量[J].分析试验室.2014，33（7）：766-770.

[11] JJG 705-2002.液相色谱仪检定规程[S].国家标准物质研究中心：国家质量监督检验检疫总局，2002：8.

[12] Cho A S，Jeon S M，Kim M J，et al.Chlorogenic acid exhibits anti-obesity property and improves lipid metabolism in high-fat diet-induced-obese mice[J].Food and Chemical Toxicology，2010，48 （3）：937-943.

[13] Dos Santos M D，Almeida M C，Lopes N P，et al.Evaluation of the anti-inflammatory，analgesic and antipyretic activities of the natural polyphenol chlorogenic acid[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin，2006，9 （11）：2236–2240.

[14] 臧志和，曹丽萍，钟 铃.芦丁药理作用及制剂的研究进展[J].医药导报，2007（07）：758-760.