火龙果EST—SSR分子标记反应体系的建立与优化

杨仕美 乔光 文晓鹏

摘 要：基于火龙果转录组测序序列设计引物，以生物学性状差异明显的11份火龙果种质DNA为材料，采用正交试验设计，对影响火龙果EST- SSR-PCR扩增的2×Taq PCR MasterMix、引物及模板DNA浓度等因素进行了优化，在此基础上对变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度及上样量进行筛选确定。以期建立适合火龙果的EST-SSR-PCR最佳反应体系。结果表明，优化后的火龙果EST- SSR-PCR扩增的最佳反应体系为：10 μL混合反应体系含基因组DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL（10 -5mol/L）的EST-SSR引物。在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中，10%的变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度、2.5μL上样量扩增效果最佳。该体系的建立可为今后利用EST-SSR标记对火龙果遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供基础。

关键词：火龙果；SSR标记；体系优化

中图分类号：S667.9

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）03-0014-07 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.003

Establishment and Optimization of EST-SSR Marker Methodology in Pitaya

YANG Shimei1，2，QIAO Guang2，WEN Xiaopeng2*

（1.College of Life Science， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China； 2. Institute of Agro-bioengineering/The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China ）

Abstract：Based on the RNA-Seq of Hylocereus polyrhizuse， EST-SSR markers were investigated. SSR primers were designed and synthesized. Genomic DNA of pitaya germplasms from 11 obviously distinguishable phenotypes were used to carry out PCR. To optimize the experimental system， the effect degree of 2×Taq PCR MasterMix， primers and DNA template concentration was analyzed respectively through orthogonal test. Furthermore， the suitable loading quantity and concentration for de-naturing polyacrylamide gel electrophoresis were determined. The results showed that the optimal amplification system was 10 μL mixture containing 30 ng DNA template， 6μL 2×PCR Mix， and 0.6 μL （10-5 mol/L） EST-SSR primer. The optimal concentration for de-naturing polyacrylamide gel electrophoresis was 10%， and the loading quantity was 2.5 μL. Our results indicated that the optimized SSR-PCR system on pitaya germplasms would provide theoretic and technical support for analysis of genetic diversity， establishment of genetic maps， gene localizations and molecular marker assisted breeding.

Key words：pitaya； EST-SSR marker； system optimization

火龍果（Hylocereus spp.）属仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）和蛇鞭柱属（Seleniereus），是近年来被广泛关注的一种新兴热带、亚热带水果[1]。贵州省“十三五规划”中，将火龙果列为第一支持产业。近年来，贵州省开展了火龙果新种质挖掘工作，发现大量具有优异性状的种质资源，为进一步开展遗传育种研究工作奠定了材料基础。随着分子生物学技术的发展，RAPD、AFLP、ISSR、SLAF-seq和MSAP[2-6]等分子标记技术已被用于火龙果种质鉴定、亲缘关系分析及遗传稳定性检测，但这些多为显性标记，不能区分纯合体和杂合体，且这些分子标记覆盖火龙果基因组比例较小，标记密度较低[7]。

简单序列重复（Simple sequence repeat， SSR）是一类由1～6个碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列[8]，由于SSR标记具有共显性、多态性丰富、重复性和稳定性好等优点，已被广泛应用于植物种质资源评价、遗传多态性分析和遗传图谱构建等研究[9]。根据建立SSR标记的序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR（gSSR）和表达序列标签SSR（EST-SSR）[10]。传统的基因组SSR标记开发费时、费力且成本高，而利用EST数据开发EST-SSR标记比较简单有效，并且EST本身是基因的一部分，可直接反应基因的表达信息，比gSSR具有更高的保守性和通用性[11]。但火龙果EST-SSR标记的研究尚未见报道。

EST-SSR是基于PCR技术的一种分子标记技术[12-13]，为确定PCR结果的可靠性，建立和优化出最佳PCR反应体系是必要的[14]。而在EST-SSR引物开发过程中，DNA电泳步骤对结果的分析处理有着直接的影响，其条带的外观、清晰度均直接影响实验结果[15]。本研究基于火龙果转录组测序序列设计引物，选取11份生物学性状差异明显的火龙果种质DNA为材料，采用正交试验设计，对影响火龙果 EST-SSR-PCR 扩增的2×Taq PCR MasterMix、引物及模板DNA 浓度等因素进行优化，并在此基础上对变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度及上样量进行筛选确定，建立火龙果EST-SSR-PCR扩增的最佳反应体系，为今后利用EST- SSR 标记对火龙果遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用火龙果种质材料均取自贵州省果树科学研究所种质资源圃，共11份（表1），取幼嫩茎尖，-80℃保存备用。

1.2 基因组DNA的提取

采用DNAsecure Plant Kit（DP320，北京天根生化科技有限公司）试剂盒提取基因组

DNA，利用微量分光光度计（北京奥凯/K5500）和2%琼脂糖凝胶电泳检测其质量和浓度，并用TE缓冲液将其稀释至约20 ng/μL，-20℃保存备用。基于前期工作中所获得的火龙果转录组测序序列进行引物设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物具体信息见表2。

1.3 PCR反应体系的优化

用2×Taq PCR Mix，将dNTPs、Taq酶和Mg2+3个因素作为整体，综合评价其对火龙果SSR-PCR反应体系的影响。采用L16（43）正交试验设计对SSR-PCR反应体系的主要影响因素2×Taq PCR Mix 用量、引物浓度和模板DNA浓度进行优化（选用火龙果种质R1的DNA作为模板），共16个处理（表3），重复三次，反应的总体积为10 μL。PCR程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸8 min，4℃ 保存。

1.4 退火温度的筛选

PCR扩增反应中，退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，每对引物最适宜的退火温度不同。以引物的參考退火温度±4℃上下浮动，分别手动设置5个温度梯度值（62℃、60℃、58℃、56℃、54℃），对火龙果种质R1的DNA模板进行PCR扩增，然后用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果确定引物最佳退火温度。

1.5 变性胶技术体系的确定

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的质量浓度分别设置为6%、8%和10%三个梯度，具体组成成分及添加顺序如表4。利用引物C13748对11份火龙果种质DNA进行PCR扩增，扩增产物在不同质量浓度的聚丙烯酰胺变性凝胶下电泳2.5 h，根据扩增情况，确定最适变性聚丙烯凝胶浓度。

1.6 聚丙烯变性凝胶电泳上样量的优化

根据已经确定的EST-SSR-PCR最佳反应体系，采用引物C13748对火龙果种质R1和R2的DNA进行PCR扩增，共设计5个上样量梯度，分别为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0μL，选择最佳上样量[16]。

1.7 PCR产物检测

琼脂糖凝胶电泳：PCR产物检测选用1×TAE（Tris-Aceticacid-EDTA， PH8.0）电泳缓冲液，在含有GoldViewⅠ的2%琼脂糖凝胶中，以5 V/cm的电压电泳一段时间，置于凝胶成像仪（英国Syngene/G：BOX）中观察并拍照保存。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：上样前先在10μL PCR扩增产物中加5μL loading buffer ，混匀，置PCR仪（ABI/Verite）上97℃变性10 min，点样量为2.5μL。然后打开电源，调试工作环境为电压150 V，电泳2.5 h。电泳结束后，小心取下凝胶，置于托盘中，用ddH2O漂洗2次，进行银染检测。

首先配置500 mL 10%的冰乙酸（50 mL的冰乙酸中加ddH2O定容至500 mL）倒入装有凝胶的托盘中，室温下置于旋转摇床上均匀晃动20 min进行固定。固定后的凝胶用ddH2O漂洗2次，倒入染色液（500 mL的ddH2O中加入0.5AgNO3和3 ml 37%的甲醛），置于旋转摇床上均匀晃动15 min进行染色。染色结束后，用ddH2O漂洗2次，加入显色液（500 mL 1.5%的NaOH加2 mL 37%的甲醛）置于摇床上晃动，直到谱带清晰时停止。倒掉显色液，用ddH2O漂洗2次。立即用数码相机拍照记录[17]。

1.8 扩增体系稳定性验证

利用优化的PCR反应程序，选择EST-SSR多态性引物C30929和C30192对11份火龙果种质进行多态性扩增，并采用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测体系反应体系的稳定性。

2 结果与分析

2.1 火龙果基因组DNA的提取

提取的火龙果基因组DNA经微量分光光度计（北京奥凯/K5500）测得其OD260/OD280值的范围是1.6～2.0，平均值1.85，OD260/OD230值范围为1.8～2.4，平均值2.08。经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。DNA电泳带集中于点样孔附近，条带清晰明亮，表明提取的DNA质量较好，可作为PCR扩增模板。

2.2 PCR体系的优化

以L16（43）正交试验设计，利用引物C13748对火龙果种质R1的DNA进行PCR扩增，扩增产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2，根据是否扩增出目的条带，以及条带的亮度和清晰度为判断依据，对各组合的扩增结果进行分析。琼脂糖凝胶电泳检测结果图中的第1、2、3、4、7和8泳道的扩增条带极为模糊，第5、6、9、10、11、15和16泳道有明显的扩增条带，但条带亮度一般。第12、13和14泳道的扩增条带最为亮度最好，其中亮度最好，条带最为清晰锐利的为泳道14，由此筛选出最优EST-SSR-PCR扩增反应体系组合为14，即：10μL体系中包含1.5μL的DNA模板，10 -5mol/L的引物0.6μL（正、反向引物各0.30μL），6μL 2×Taq PCR MasterMix及适量ddH2O。

2.3 引物退火温度筛选

PCR反应中，退火温度可能直接影响模板與引物的特异性结合。试验设置5个退火温度（62℃、60℃、58℃、56℃、54℃），对火龙果种质R1的DNA进行PCR扩增（图3）。结果表明，引物C30929在退火温度为62℃时，无扩增条带。退火温度低于58℃时，出现扩增条带弥散、背景增强的现象。而退火温度为58℃时，所得扩增条带最为清晰明亮，背景最浅，由此确定引物C30929的最佳退火温度为58℃。引物C13748的扩增中，当退火温度为58℃时，所得扩增条带最为清晰明亮，当退火温度为62℃时，出现非特异性扩增条带，且主带亮度较弱。所以确定C13748的最佳退火温度为58℃。引物C30192的退火温度确定方法如上，其最佳退火温度为61℃。

2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系

利用引物C13748对11份火龙果种质DNA进行PCR扩增，扩增产物在不同质量浓度的聚丙烯酰胺变性凝胶下电泳2.5 h，电泳结果显示（图4），当变性PAGE胶的浓度为6%时（图4A），电泳条带聚集在一起，不能很好的分散开来，无法区分条带数目。当变性PAGE胶的浓度为8%（图4B）时，由于随着胶浓度的增加，分辨能力有所加强，条带趋于分散，但还是不够清晰，对条带的准确判读有一定的影响。当胶的浓度继续增加到10%（图4C）时，扩增条带完全分散开来，可以准确的进行条带统计，但染色背景不够清晰，需改善染色操作过程。综合评价，火龙果EST-SSR聚丙烯酰胺变性凝胶电泳最适质量浓度为10%。

2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳不同上样量

采用引物C13748对火龙果种质R1和R2的DNA进行PCR扩增，根据不同上样量的10%变性聚丙烯酰胺电泳结果图分析发现（图5），特异性和非特异性条带的区分不受上样量的影响。但当上样量为1.0μL（图5中的A1、A2泳道）、1.5μL（图5中的B1、B2泳道）和2.0μL时（图5中的C1、C2泳道），扩增条带较为模糊，不易辨认。上样量为2.5μL（图5中D1、D2泳道），扩增条带带型清晰泳道背景浅，利于多态性位点统计。上样量为3.0μL（图5中E1、E2泳道）和3.5μL（图5中F1、F2泳道），扩增条带带型仍可清晰辨认，但有稍有弥散趋势，泳道背景也有所加深。因此，最佳上样量应为2.5μL。

2.6 扩增体系稳定性验证

利用已经优化的PCR反应程序，选择EST-SSR多态性引物C30929和C30192对采自贵州省果树研究所种质资源圃的11份火龙果种质进行10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性扩增。扩增结果显示，不同的引物均能够扩增出清晰、明亮的目的条带，表明本试验所筛选的PCR扩增体系稳定性好，可用于火龙果EST-SSR扩增反应。

泳道1～11：11份火龙果种质在10%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳扩增结果；M为DNA Marker。C30929和C30192 为引物。

3 结论与讨论

目前火龙果已开发的分子标记缺乏共显性，尚不能满足分子标记辅助育种的需要。利用转录组数据建立的SSR标记来源于基因的转录区，不依赖于物种的全基因组信息，共显性高，重复性好，可直接反应基因的表达信息，且操作简便、经济、信息量大[18]，是一种较为经济高效的DNA分子标记开发策略，目前已被广泛地应用于种质遗传多样性评价、亲缘关系分析以及遗传图谱构建[19]。由于EST- SSR 标记易受反应体系和扩增程序的影响，且EST-SSR 分子标记技术是基于 PCR反应过程的，且各因素间又存在互作效应[20]，因此，欲获得清晰稳定的扩增产物，对EST-SSR-PCR反应扩增体系和反应程序进行优化是非常重要的。在整个EST-SSR分子标记技术中，不仅涉及了 PCR 扩增体系中的各因子和扩增程序，而且涉及DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，其对试验结果的影响也是极大的。DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是EST-SSR引物筛选与多态性检测中一种比较普遍的电泳技术，与琼脂糖凝胶电泳相比，所需样品量小，分辨率较高，能分辨相差几个碱基的核酸小片段[21]。因此广泛应用于多态性分析、样品的分离和纯度鉴定等方面，但是实验过程操作复杂，影响因素较多。需要根据所分离的DNA片段长度配制不同分子质量浓度的凝胶，摸索最佳的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件，为火龙果EST-SSR标记的开发奠定基础。

随着分子生物技术的发展，采用单因素或正交试验设计对Mg2 +浓度、dNTPs 浓度、Taq 用量、引物浓度的含量进行优化，建立SSR分子标记体系的研究较多，如小桐子、小豆、木薯[22-24]等植物的SSR分子标记反应体系的建立。近年来，2×Taq PCR Mix常用于PCR扩增反应，是将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液预先配制成2倍浓度的混合物。2×Taq Master Mix专为常规PCR扩增反应优化，扩增长度可达8 kb，能对4 kb及其以下长度的片段进行高效地扩增。使用时只需再加入模板和引物即可进行PCR反应，大大地简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染。而再单独对Taq酶、dNTP混合物和MgCl2浓度的含量进行优化显得有些繁琐和多余。所以本试验在优化EST-SSR-PCR反应体系过程中，用2×Taq PCR Mix，将dNTPs、Taq酶和Mg2+3个因素作为整体，综合评价其对火龙果EST-SSR-PCR反应体系的影响。最终筛选出最优EST-SSR-PCR扩增反应体系组合为14，即10 μL混合反应体系含基因组DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL（10 -5mol/L）的EST-SSR 引物，其余用ddH2O补足至10μL。

退火温度决定 PCR特异性和产量，温度过高引物不能与模板牢固结合，过低则容易使引物和模板错配，非特异性产物增加[25]。可通过设置一系列梯度，以确定某些反应的特定退火温度，本试验设置5个温度梯度（62℃、60℃、58℃、56℃、54℃），进行PCR扩增，利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，最终确定不同引物的最佳退火温度。

利用不同质量浓度变性聚丙烯凝胶对采自贵州省果树研究所种质资源圃内的11份材料进行电泳检测发现，6%、8%和10%質量浓度的凝胶对相同PCR扩增产物进行电泳检测产生的结果差异明显。当质量浓度为10%时，所获得的扩增条带最为清晰，能够清楚的对条带进行判读。当质量浓度为6%时，扩增产物聚集在一起，条带无法区分开。在其它条件都相同时，质量浓度较高的变性聚丙烯凝胶更容易将条带相近的PCR产物分开，而在低浓度的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，条带较弥散，不易分开，不利于基因型的判断。火龙果种质DNA通过引物C30929和C30192在已经筛选出的扩增反应条件下进行PCR扩增，然后采用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性扩增，均能扩增出清晰、明亮的目的条带，表明本试验所筛选的PCR扩增体系稳定性好，可用于火龙果EST-SSR扩增反应。此外，本试验对上样量进行筛选发现，最佳上样量为2.5μL，此时扩增条带带型清晰泳道背景浅。而上样量过低时扩增条带较为模糊，不易辨认，上样量过高则会出现条带稍有弥散趋势，泳道背景也有所加深，不利于条带统计。

本研究通过正交试验得到了火龙果稳定的EST-SSR-PCR反应体系（10μL）含基因组DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL（10 -5mol/L）的EST-SSR 引物，其余用ddH2O补足至10μL。在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中，利用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度、2.5μL上样量扩增效果最佳。建立的火龙果 SSR-PCR 扩增的最佳反应体系，可为火龙果种质鉴定及遗传多样性分析建立技术基础。

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