玉米赤霉烯酮降解菌的分离鉴定及其降解特性研究

潘丽婷 徐圣佳 胡晓丹 徐丽梅 史建荣 顾振新 徐剑宏

(南京农业大学1，南京 210095) (江苏省食品质量安全重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地；农业部农产品质量安全风险评估实验室(南京)；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心; 江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所2，南京 210014)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又称F-2毒素，是一种由镰刀菌产生的类雌激素性质的真菌毒素，最早于1962年由Stob从患赤霉病的玉米中分离到[1]。ZEN在世界各地的谷物及农副产品中广泛存在[2-4]。 2012年，王金勇等[5]对我国的饲料和谷物受ZEN污染水平的调查结果显示，玉米中平均值为0.332 mg/L，最高值为1.961 mg/L；DDSG(酒糟蛋白)饲料中平均值为0.567 mg/L，最高值为2.811 mg/ L；麸皮中平均值为0.409 mg/ L，最高值为3.274 mg/L。2012-2014年间，华中地区的食品与食品添加剂的检测结果显示，90.2%的样品中含有ZEN毒素[6]。这说明我国食品及饲料中ZEN污染现状不容乐观。

ZEN性质稳定，在储藏、加工和高温烹调条件下均不发生降解，通过食物进入体内，危害人和动物的健康[7]。ZEN对人畜的毒性主要是造成动物体内生殖激素分泌紊乱，破坏动物生殖发育系统[8]。动物中最为敏感的是猪，可使其出现假发情、不孕、假孕、流产死胎等症状[9]。ZEN还可以诱导动物免疫细胞毒性，降低动物的免疫能力，引起基因突变和细胞核病变；引发肝肾组织退行性变化，造成肝肾功能紊乱；激活内源性逆转录病毒和促进相关肿瘤抗原的表达，从而诱发肿瘤的发生[10]。

鉴于ZEN污染的普遍性和危害性，对其脱毒控制一直受到科研人员的关注。常用的物理和化学脱毒法因其在除毒的同时，也会被吸附或者改变谷物中营养成分。因此，目前脱毒的最佳方法是生物去毒[11]。在ZEN 微生物降解方面，早期分离到的主要是真菌，如el-Sharkawy等[12-15]发表了多篇关于真菌转化ZEN的文章。Takahashi等[4]筛选到一株粉红色螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)IF7063，可将ZEN转化为无雌激素活性的代谢产物。采用细菌脱毒的研究较晚，据报道PseudomonasputiaZEA-1能够降解100～200 mg/L ZEN[16]。程波财等[17]分离到一株藤黄微球菌，该菌在LB培养基中培养120 h后能够降解2 mg/ L的ZEN。Tinyiro等[18]分离到能吸附和降解ZEN的两株芽孢杆菌。尽管报道了不少能降解ZEN的微生物，但是真正能够应用的很有限。因此，需要继续筛选ZEN降解菌，扩大菌种资源库，并应用于实际生产，这对于控制谷物中的ZEN毒素污染，保障人畜健康具有重要应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品和培养基

样品：2015年江苏省不同小麦产区采集的小麦样品。

培养基：基础盐培养基(MM)：K2HPO4(2.5 g/L)、KH2PO4(1.2 g/L)、 NH4NO3(1.0 g/L)、MgSO4.7H2O(0.2 g/L)、Ca(NO3)2.4H2O (0.4 g/L)、NaCl (0.5 g/L)和Fe2(SO4)3(0.001 g/L) (pH 7.0)，用于毒素降解菌的驯化富集；LB培养基：酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，培养基121 ℃灭菌20 min。

1.1.2 试剂

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯级，美国ROE公司；玉米赤霉烯酮标准品SIGMA公司；酵母粉、胰蛋白胨为食品级：上海生工生物有限公司; KH2PO4、K2HPO4、NH4NO3、MgSO4.7H2O、Ca(NO3)2.4H2O、Fe2(SO4)3、NaCl均为分析纯：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米赤霉烯酮的提取检测方法

玉米赤霉烯酮的提取：称取5 g玉米粉(精确到0.01 g)置于150 mL离心管中，加入25 mL提取液(84%乙腈)，180 r/min振荡提取30 min，8 000 r/min 离心5 min后取上清，取3 mL上清液润洗氨基柱，取3 mL上清液过净化柱，流速1 d/s，取3 mL 上清液淋洗2次，流速2 d/ s，收集滤液，氮气吹干后，用50%甲醇重溶，过0.22 μm的滤膜后，上液质联用仪检测。

液相色谱检测法：在文献[19, 20]基础上作部分改进，具体条件为：安捷伦Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，粒径 5 μm)；进样量：20 μL；流动相：乙腈∶水(80∶20v/v)；流速：1.0 mL/min；紫外检测器，检测波长：236 nm。

液质联用检测：在文献[21, 22]基础上作部分改进，条件为：AB3500 LC/MS，四极杆质谱系统。液相色谱条件：进样量：5 μL；流动相A：5 mmol/L醋酸铵水，B：色谱甲醇，梯度洗脱(见表1)；质谱参数：电喷雾电离模式(ESI-)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度：600 ℃，雾化气：50 psi，辅助气：50 psi，气帘气：35 psi，喷雾电压：4500 V，碰撞室射出电压：6 V，ZEN检测的多反应监测质谱参数见表2。

ZEN降解率=(对照组ZEN含量-样品组ZEN含量) ÷对照组含量×100%。

表1 流动相流速及梯度

表2 ZEN检测的多反应监测质谱参数

1.2.2 ZEN降解菌的分离及纯化

称取5 g麦粒，用75%的乙醇浸泡3 min后，用无菌水洗涤3次，然后加入用无菌水清洗后的粉碎仪中，粉碎后，加入50 mL无菌水，放置于30 ℃，180 r/min 的摇床中，振荡1 h后，10 000 r/min离心5 min后取上清，以10%的接种量加入到ZEN质量浓度为10 mg/L的MM培养基中，于30 ℃，180 r/min的摇床中连续培养7 d，以相同的方法转接5次，用高效液相色谱法检测培养液中ZEN含量。把具有ZEN降解效果的富集液涂布于LB平板上，30 ℃培养72 h后，选取不同的单菌落进行划线纯化后。再将纯化后的单菌落接种于ZEN质量浓度为10 mg/L的MM培养基中，以不加菌、含有相同ZEN质量浓度的MM培养基为空白对照，30 ℃，180 r/min的摇床中连续培养72 h 后，用高效液相色谱检测ZEN含量。选取降解ZEN效果明显的菌株，再用液质联用的方法进一步验证，最终获得ZEN高效降解菌株。

1.2.3 降解菌的菌种鉴定

形态鉴定：把降解菌接种到LB液体培养基中，30 ℃培养48 h后，用蔡司扫描电子显微镜(EVO-LS10)观察菌体的形态；生理生化鉴定[23,24]：由中国普通微生物菌种保藏管理中心进行鉴定；细菌16S rDNA 基因序列测定：①基因组DNA的提取：采用高盐法[20]提取降解菌的基因组DNA；②16S rRNA序列的PCR反应引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3’；③gyrA基因引物：gyrA-F: CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT，gyrA-R:CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT；④测序：由上海生工生物工程技术有限公司纯化和测序；⑤序列数据处理：测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16S rDNA 源和gyrA源的公认标准序列数据，使用MEGA5[25]，构建菌株的系统进化树，最后综合分析，确定降解菌的种属地位。 1.2.4 环境因素对降解菌降解玉米赤霉烯酮的影响实验

将降解菌7D3-2单菌落接种于LB液体培养基中，30 ℃、180 r/min培养至OD600为1.0左右，10 000 r/min 离心5 min，弃上清后，加入等体积的无菌水洗涤沉淀，10 000 r/min离心5 min后弃上清，再用和培养液等体积无菌水悬浮沉淀，制成种子液。1)培养温度对菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响：将种子液按5%的接种量接入到含10 mg/LZEN的MM培养基中，分别于15、20、25、30、35、40 ℃，180 r/min摇床培养，同时以不接菌的含有相同ZEN质量浓度的MM培养基作为对照，每组设3次重复，48 h之后取样，采用液质联用的方法测定不同培养液中ZEN的含量。2)pH对菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响：将种子液按5%的接种量接入到含10 mg/L ZEN、pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0的MM培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养，同时以不接菌的含有相同ZEN质量浓度、pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0的MM培养基为对照，每组设3个重复，48 h之后取样，采用液质联用的方法测定不同培养液中ZEN的含量。3)接种量对菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响：将种子液分别按0.5%、1%、2%、5%、10%及20%体积比接入到含10 mg/L ZEN的MM培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养，同时以不接菌的含有相同ZEN质量浓度的MM培养基作对照，每组设3个重复，48 h之后取样，采用液质联用的方法测定不同培养液中ZEN的含量。(4)ZEN初始质量浓度对菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响：将种子液按5%的接种量接入到含有ZEN初始质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg/ L ZEN的MM培养基中，30 ℃，180 r/min 摇床培养，同时以不接菌的含有相同ZEN质量浓度的MM培养基作为对照，每组设3次重复，48 h后取样，采用液质联用的方法测定不同培养液中ZEN含量。

1.2.5 玉米赤霉烯酮降解物质的定域实验

采用渗透冲击法[26]，按照下列程序分步提取：先取培养24 h后的7D3-2菌液100 mL 室温离心(6 000 r/min，10 min)上清液(S1)冻存；沉淀(P1)用10 mL(pH8.0)0.01 mol/ LTris-HCl重悬，离心(4 ℃，6 000 r/min，10 min)，洗涤2次，上清液(S2)冻存；沉淀(P2)以10 mL，25%蔗糖溶液重悬，于25 ℃震荡10 min，离心(4 ℃，13 000 r/min，10 min)，上清液(S3)冻存；沉淀(P3)加冷的双蒸水重悬，在冰水浴中震荡10 min，离心(4 ℃，13 000 r/min，10 min)，上清液(S4)冻存；沉淀(P4)重悬于10 mL 0.01 mol/L Tris-HCl(pH7.5)中，在冰浴中超声波破碎1 min，重复5次，间隔1 min，再离心(4 ℃，15 000 r/min，20 min)，上清液(S5)冻存，沉淀(P5)弃去，将S1、S2和S3合并，即为胞外提取液，S4为膜周质提取液，S5为膜内提取液。取三种提取液，加入到含有5 mg/L ZEN的MM培养基中，测定不同提取液对ZEN的降解能力，从而获得ZEN降解物在细胞中的分布情况。

1.2.6 7D3-2对玉米粉中ZEN的降解实验

称取含有ZEN的玉米粉600 g，充分混合后平均分成12份，设对照和处理，空白：不做任何处理；对照1：加入200 mL无菌水；对照2：加入200 mL LB培养液；处理1：加入200 mL 7D3-2 LB培养液(OD600=2.0)。对照1、对照2、处理1置于30 ℃摇床中，180 r/min培养48 h后，40 ℃烘干，提取玉米粉中的ZEN，采用液质联用的方法检测样品中ZEN含量，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 ZEN降解菌的初筛

以ZEN为选择压力，对采集到的样品进行富集驯化培养，得到3组对ZEN具有降解功能的富集液，这3组富集液对ZEN的降解效果均达到90%以上，在LB平板上对这三组富集液进行涂布培养，对平板上生长出来的菌落进行ZEN降解功能的验证，最终得到15株ZEN降解菌株。选择降解能力最好的菌株7D3-2进行后续研究。

2.2 7D3-2对ZEN的降解

按5%的接种量把7D3-2的种子液接种到含有10 mg/L ZEN毒素的MM培养基中，30 ℃、180 r/min摇床中培养48 h后，取样，加入色谱纯乙腈，使乙腈的终体积分数为70%，超声混匀后过孔径0.22 μm的有机相针头滤器，用高效液相色谱检测培养液中的ZEN含量，检测结果见图1。结果表明，ZEN在7D3-2 的作用下，48 h后，基本检测不到 ZEN，这表明7D3-2对ZEN毒素有很好的降解功能。

2.3 ZEN降解菌株7D3-2的鉴定

7D3-2在LB培养基上培养，其菌落呈乳白色，好氧，有芽孢，革兰氏染色阳性，通过蔡司扫描电子显微镜EVO-LS10观察，7D3-2菌体呈杆状，大小约为0.5 μm×1.6 μm。

生理生化特征试验表明：7D3-2能利用葡萄糖、明胶、蔗糖、柠檬酸等，不能利用糊精、D-麦芽糖、D-半乳糖、D-果糖等(表3)。

将7D3-2的16S rDNA基因序列和gyrA基因序列在NCBI进行Blast比对，从GenBank数据库中获得相关的标准序列数据进行系统发育分析，结果见图2，7D3-2的16S rDNA基因序列与Bacillusamyloliquefaciens，Bacillussubtilis等的同源性高达99%，无法确定其属种。因此，继续对7D3-2的gyrA基因序列与芽孢杆菌属的种进行比较，结合遗传距离、最后综合7D3-2的形态特征、生理生化特征以及遗传发育地位，参照常见细菌系统鉴定手册以及伯杰氏细菌鉴定手册，7D3-2被初步确定为解淀粉芽孢杆菌属(Bacillusamyloliquefaciens)[23,25]。

图1 7D3-2对ZEN降解的液相色谱图

表3 7D3-2的生理生化特性

项目结果项目结果项目结果项目结果接触酶+硝酸盐还原+葡萄糖利用+蔗糖利用+革兰氏染色+酪素水解+D-果糖利用+糊精利用-芽孢+尿酶+D-甘露糖利用+松二糖利用-硝酸盐还原+精氨酸双水解+D-麦芽糖利用-果胶利用-氧化酶+明胶液化+庆大霉素抗性-吐温利用-接触酶+W柠檬酸利用-D-半乳糖利用-丙酸利用-

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“+W”表示弱阳性。

图2 基于7D3-2 16SrDNA、gyrA基因序列的系统进化发育树

2.4 环境因素对7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响

2.4.1 培养温度的影响

培养温度对菌株7D3-2降解ZEN的影响如图3所示，在15～35 ℃温度范围内，7D3-2对ZEN的降解率呈现先升高后降低的趋势，最适温度是30 ℃，此温度下ZEN的降解率高达96.82%，其次是35 ℃和25 ℃。说明在25～35 ℃范围内，菌株7D3-2产生的降解物质活性较高。

图3 培养温度对菌株7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响

2.4.2 初始pH的影响

起始pH对菌株7D3-2降解ZEN的影响如图4所示，在pH在4.0～9.0的范围内，7D3-2对ZEN的降解率呈现先增高后降低的趋势，在pH7.0时，ZEN的降解率最高，达95.12%，其次是pH8.0、pH6.0。这说明当pH为6.0～8.0范围时，7D3-2产生的降解物活性较高，过酸和过碱的条件下，ZEN降解活性大幅度降低。

图4 初始pH对菌株7D3-2的降解玉米赤霉烯酮的影响

2.4.3 接种量的影响

接种量对菌株7D3-2降解ZEN的影响如图5所示。由图5可以看出，在接种量在0.5%～10%的范围内，ZEN的降解率呈现升高的趋势，ZEN的降解率最高可达 96.22%，当接种量大于10%时，ZEN降解率趋于平稳，不再增加。因此从经济节约的角度出发，7D3-2降解ZEN的最适接种量为10%。

图5 接种量对菌株7D3-2的降解玉米赤霉烯酮的影响

2.4.4 ZEN初始质量浓度的影响

ZEN质量浓度对7D3-2降解玉米赤霉烯酮的影响如图6所示。从结果可以看出， ZEN初始质量浓度为1.0～100.0 mg/L范围内，ZEN降解率先处于平稳不变然后再逐渐降低的趋势：当ZEN质量浓度为1.0～25.0 mg/L之间时， ZEN的降解率基本不变，都大于95%，当ZEN质量浓度大于25.0 mg/L时，降解率显著降低；但是如果从ZEN的绝对降解量来看，ZEN初始质量浓度为1.0 ～100.0 mg/L范围内，ZEN的绝对降解量随着ZEN初始质量浓度的增加而增加，两者呈正相关。

图6 ZEN初始质量浓度对7D3-2降解ZEN的影响

2.5 玉米赤霉烯酮降解物质定域实验结果

分别测定了不同部位的降解物质对ZEN的降解效率，结果见图7。从结果可以看出，在菌株7D3-2中，ZEN降解物质主要位于胞外提取液中，胞内提取物和周质空间中的物质几乎没有ZEN降解活性，因此7D3-2中ZEN降解物质是分泌到细胞外的。

图7 ZEN降解物质的定域实验

2.6 7D3-2对玉米粉中ZEN的降解效果

含有ZEN的玉米粉经过处理后，放入30 ℃培养48 h后，提取各处理样品中ZEN，并用液质联用的方法检测提取液中ZEN的含量，结果见图8。从结果可以看出，和空白样品相比，对照样品1和2中ZEN质量浓度降低达到了极显著水平，降解率为11.83%和17.82%；加入降解菌7D3-2处理的样品中ZEN含量显著低于对照1和对照2，降解率可以达到75.96%，因此7D3-2对玉米粉中ZEN具有很好的降解效果。

图8 7D3-2对玉米粉中ZEN的降解

3 结论

3.1 采用富集培养的方法从麦粒中筛选到一株ZEN降解菌7D3-2。该菌株对ZEN的降解能力达95%以上；通过形态、生理生化特性以及16S rDNA、gyrA基因系统进化发育地位分析，7D3-2被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。3.2 7D3-2对ZEN有良好的降解效果，在含10 mg/L ZEN的MM培养基中，48 h对ZEN的降解率可达到95%以上；7D3-2降解ZEN的最适温度为30 ℃，最适pH为7.0；当接种量小于10%时，ZEN的降解率与7D3-2接种量成正比；在ZEN初始质量浓度为1.0～25.0 mg/L时，ZEN降解率差异不显著，但当ZEN质量浓度大于25.0 mg/L时，ZEN降解率与其初始质量浓度呈反相关，但是ZEN被降解的绝对量与初始质量浓度呈正相关。

3.3 降解物的定域实验表明：7D3-2中降解ZEN的物质位于胞外上清液中；7D3-2不仅对培养液中ZEN具有降解效果，对玉米粉中的ZEN也有很好的降解效果。