Box-Behnken法优化酸性复合酶与碱性复合酶三段式提取红树莓籽油的研究

李晓静 韩宗元,2 王晓彤 陆辰燕 王仙纷 吴秀月 肖志刚

(沈阳工学院生命工程学院1，抚顺 113122) (沈阳农业大学食品学院2，沈阳 110866) (沈阳师范大学粮食学院3，沈阳 110034)

红树莓籽是红树莓果实加工过程的副产物，约占红树莓鲜重的10%，因红树莓籽的萌发率很低，一般不作播种，常被丢弃[1]，但红树莓籽油含有丰富的亚油酸、α-亚油酸、油酸和棕榈酸等，具有显著的抗衰老、防晒等功能,是具有良好加工前景的油脂。研究红树莓籽油一方面可以了解籽油的成分及保健作用；另一方面可以提高红树莓果综合利用价值[2]。红树莓籽油提取方法有压榨法[3]、浸出法[4]、索氏提取法[5]、超声波辅助提取法[6]、微波辅助提取法[7]、超临界流体萃取法[8]和酶法提取等[9]。

水酶法是一种新兴的植物油脂提取技术，是利用酶制剂破坏、降解植物种子的细胞壁，使油脂游离出来的一种新型提取技术，因其工艺条件温和，适用于油料作物，受到广泛关注。水酶法提取大豆、花生、葵花籽、油菜籽等油脂已有深入研究[10]，刘旷[11]分别采用7种商业蛋白酶进行酶解，以油脂得率为评价指标，筛选出Alcalase 2.4 L水解酶用于提取大扁杏仁油。王丽波等[12]为了提高南瓜籽油的出油率和油脂品质，采用水酶法提取南瓜籽油，结果表明：酸性蛋白酶:纤维素酶:果胶酶的复合酶配比为1:6:6时，南瓜籽油出油率最高为38.34%，且所提取的南瓜籽油色泽明亮，澄清透明，富含不饱和脂肪酸、植物甾醇和维生素E等营养成分，理化性质也优于超临界二氧化碳法和超声波溶剂萃取法。张佰清等[13-14]研究微波和超声波辅助提取红树莓籽油的生产工艺，并得出最佳工艺条件，且提油率分别为17.57%、12.97%。扶庆权[15]以正己烷为有机溶剂，采用正交实验优化微波辅助提取红树莓籽油的最佳工艺，其红树莓籽油得率为16.52%；辛秀兰等[2]采用超声波辅助溶剂浸提法提取红树莓籽油，出油率为13.50%。但是水酶法提取红树莓籽油的研究，在国内外还很少，且红树莓籽油作为植物精油，营养价值高，而水酶法具有工艺设备简单，处理条件温和，操作安全等特点，可以最大限度的保持红树莓籽油的营养成分。本实验以红树莓籽为原料，采用不同复合酶法提取红树莓籽油，并利用Box-Behnken法优化其工艺参数，为开发红树莓籽油提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓籽(产地沈阳)；胃蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶：沈阳瑞丰精细化学品有限公司；石油醚、乙醚：沈阳市华森试剂公司；盐酸、氢氧化钠等：国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LD210-2R型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；pH计：杭州美控自动技术有限公司；GFL-70型鼓风干燥箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；台式离心机：金坛市国旺实验有限公司；索氏提取器：建湖县明启玻璃仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

将鲜红树莓去除果肉，清洗后，收集红树莓籽，将红树莓籽放置于鼓风干燥箱中，于105 ℃杀青灭酶处理15 min，然后在65 ℃条件下恒温烘干至水分含量在14%左右，最后将干燥后的红树莓籽放入高速万能粉碎机中粉碎，过60目筛，收集红树莓籽粉密封，备用。

1.3.2 实验方法

准确称取处理后一定量的红树莓籽粉至于烧杯中，加入5倍水，混匀后进行酶解实验，酸性复合酶水解：酶添加顺序，酸性纤维素酶(pH=5，50 ℃)、果胶酶(pH=3.5，50 ℃)、胃蛋白酶(pH=2，37 ℃)酶解时间分别为70 min，50 min,60 min，酶解总时间3 h；碱性复合酶水解：酶添加顺序，α-淀粉酶(pH=7.0，60 ℃)、胰蛋白酶(pH=8.0，37 ℃)、碱性蛋白酶(pH=10，45 ℃)酶解时间分别为60 min，60 min,60 min，酶解总时间3 h。反应完成后100 ℃灭酶10 min，4 500 r/min离心30 min，收集上清液及残渣，将残渣于105 ℃处理15 min，然后在65 ℃条件下恒温烘干至恒重，对烘干至恒重的的残渣进行称量，用索氏提取法测定残渣中的含油量及计算提油率。

1.3.3 单因素实验

分别以胃蛋白酶添加量0.25%～2.0%、果胶酶0.5%～3.0%、酸性纤维素酶0.5%～3.0%、α-淀粉酶0.5%～3.0%、胰蛋白酶0.5%～3.0%和碱性蛋白酶0.5%～3.0%为单因素，考察各因素对红树莓籽油提取率的影响。

1.3.4 响应面分析实验设计

根据单因素实验结果，采用Box-Behnken设计方法，酸性复合酶组合：以胃蛋白酶、酸性纤维素酶、果胶酶添加量为自变量，以红树莓籽油提取率为响应值，根据Box-Behnken法设计原理，设计响应面分析实验见表1。

碱性复合酶组合：以α-淀粉酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶添加量为自变量，以红树莓籽油提取率为响应值，根据Box-Behnken法设计原理，设计响应面分析实验见表2。

表1 酸性复合酶因素水平编码表

表2 碱性复合酶因素水平编码表

1.3.5 提油率计算

原料含油率及残渣中油脂含量测定采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》。

提油率(%)=(A×B-C×D)/(A×B)×100%[16]

式中：A为原料红树莓籽质量/g；B为原料红树莓籽含油率；C为酶解后残渣质量/g；D为酶解后残渣含油率。

1.3.6 数据分析

所有实验均进行3次平行实验。数据采用Desigh expert 8.06进行分析。不同处理间的数据采用多重比较方法，显著水平为0.05，采用标记字母法进行标记。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酸性复合酶添加量对提油率的影响

由图1可知，在0.25%～0.50%范围内，随着胃蛋白酶添加量的增加，红树莓籽的出油率逐渐增大，当胃蛋白酶的添加量在0.50%时，红树莓籽的提油率最高，当胃蛋白酶添加量在0.50%两端时，红树莓籽的出油率呈现下降的趋势。胃蛋白酶可与树莓籽外壁的蛋白结合，破坏细胞壁结构，有助于油脂提取，但其外壁还有果胶、纤维素等多糖，从而影响胃蛋白酶提油的效果[17-18]。图1可知，在0.50%～2.00%范围内，随着果胶酶添加量的增加，红树莓籽的提油率逐渐增大，当果胶酶添加量为2.00%时，红树莓籽的提油率达到最大，当果胶酶添加量在2.00%两侧时，红树莓籽提油率出现下降趋势。其原因在于果胶酶可以与细胞壁中果胶结合，破坏其结构，提高出油率，但细胞壁中蛋白质和纤维素、半纤维素等成分会影响其提油效果[17]。随着酸性纤维素酶添加量的增加，红树莓籽的出油率先变大后保持稳定，当纤维素酶的添加量在1.00%时，红树莓籽的出油率最大，见图1。这是因为细胞壁中主要成分为纤维素和半纤维素，酸性纤维素酶可以很好将其酶解，使细胞壁成分发生降解，因此酸性纤维素酶对提油率的影响基本保持稳定，变化幅度较小[17]。但三种酸性酶单一作用都有一定的局限性，对其细胞壁结构破坏程度不完全，因此需要将三种酶进行复合使用。

图1 酸性复合酶添加量对提油率影响

2.1.2 碱性复合酶添加量对红树莓籽提油率的影响

由图2可知，随着α-淀粉酶的添加量的增加，红树莓籽的提油率缓慢变大，当α-淀粉酶的的添加量在2.50%时，红树莓籽的提油率最大。当α-淀粉酶的添加量在2.50%两侧时，红树莓籽的提油率均降低。因为油脂除了有细胞壁结构保护外，还与多糖结合形成脂多糖，所以α-淀粉酶可以将多糖水解，使油脂游离出来，提高出油率。图2可知，在0.50%～2.00%范围内，随着胰蛋白酶添加量的增加，红树莓籽的出油率不断的增加，当胰蛋白酶添加量在2.00%时，红树莓籽的出油率最高。因为胰蛋白酶可与蛋白质结合破坏细胞壁结构，有助于油脂释放。在0.50%～2.00%范围内，随着碱性蛋白酶添加量的增加，红树莓籽的提油率也随着增加，当碱性蛋白酶添加量在2.00%时，红树莓籽的提油率最高，见图2。因为油脂易与蛋白质结合形成脂蛋白，碱性蛋白酶可与蛋白质结合，有助于油脂分离，聚集[17-18]。单一碱性酶也存在酸性酶的问题，因此碱性酶也需要复合提高树莓籽出油率。

图2 碱性复合酶添加量对提油率影响

2.2 响应面实验分析

2.2.1 酸性复合酶提取红树莓籽油的响应面实验与分析

以胃蛋白酶添加量A，果胶酶添加量B，酸性纤维素酶添加量C为自变量，红树莓籽油提油率Y1为响应值，优化实验设计和响应值如表3所示，分别进行12组析因实验，5组中心实验，通过实验优化降低实验误差。

通过Design expert 8.06得到以下方程：

提油率Y1=86.02-0.2A-0.18B+0.18C-0.053AB+0.22AC+0.3BC-2.75A2-0.031B2-C2

表3 响应面实验结果分析(酸性复合酶)

按照显著性检验，一次项：A、B、C；二次项：AC、BC、A2、C2，上述提到的因素项影响显著(P<0.05)。表3反映通过F检验得到因素贡献率为：A>C>B(胃蛋白酶添加量>果胶酶添加量>酸性纤维素酶添加量)。

表4 回归与方差分析结果

2.2.2 碱性复合酶提取红树莓籽油的响应面实验与分析

以α-淀粉酶添加量A，胰蛋白酶添加量B，碱性蛋白酶添加量C为自变量，红树莓籽油提油率Y2为响应值，优化实验设计和响应值如表5所示，分别进行12组析因实验，5组中心实验，通过实验优化降低实验误差。

通过Design expert 8.06得到以下方程：

提油率Y2=88.62+0.14A-0.18B+0.19C+0.28AB-0.14AC+0.3BC-2.84A2-0.041B2-1.04C2

表5 响应面实验结果分析(碱性复合酶)

按照显著性检验，一次项：A、B、C；二次项：AB、AC、BC、A2、C2，上述提到的因素项影响显著(P<0.05)。表6反映通过F检验得到因素贡献率为：C>B>A(碱性蛋白酶添加量>胰蛋白酶添加量>α-淀粉酶添加量)。

表6 回归与方差分析结果

2.2.3 最佳复合酶提取红树莓籽油条件的确定及验证实验

酸性复合酶水解红树莓籽提取红树莓籽油的响应面分析法得到的最佳条件为：胃蛋白酶添加量0.76%，果胶酶添加量1.51%，酸性纤维素酶添加量1.07%，提油率(86.11±0.09)%；碱性复合酶水解红树莓籽提取红树莓籽油的响应面分析法得到的最佳条件为：胰蛋白酶添加量1.52%，碱性蛋白酶添加量1.99%，α-淀粉酶添加量2.52%，提油率为(88.75±0.08)%。

在最佳条件下进行3次平行实验，胃蛋白酶添加量0.76%，果胶酶添加量1.51%，酸性纤维素酶添加量1.07%，3次平行实验提油率分别为85.98%，86.21%，86.10%，平均值为86.10%；胰蛋白酶添加量1.52%，碱性蛋白酶添加量1.99%，α-淀粉酶添加量2.52%，3次平行实验提油率分别为88.63%，88.85%，88.71%，平均值为88.73%。这说明相应值符合回归预测值，并且模型能预测红树莓籽油提油率的实际条件。

3 结论

通过Box-Behnken实验设计及响应面分析，对水酶法提取红树莓籽油的工艺进行优化，酸性复合酶水解红树莓籽提取红树莓籽油的响应面分析法得到的最佳条件为：胃蛋白酶添加量0.76%，果胶酶添加量1.51%，酸性纤维素酶添加量1.07%，提油率可达86.10%；碱性复合酶水解红树莓籽提取红树莓籽油的响应面分析法得到的最佳条件为：胰蛋白酶添加量1.52%，碱性蛋白酶添加量1.99%，α-淀粉酶添加量2.52%，提油率可达88.73%。

对比两种复合酶水解提取法，碱性复合酶水解法提取红树莓籽油的提取率略高于酸性复合酶水解法，但两种复合酶酶解提取法均大于单酶提取法，通过F检验得到因素贡献率为：碱性复合酶的因素贡献率依次为：碱性蛋白酶添加量>胰蛋白酶添加量>α-淀粉酶添加量)；酸性复合酶的因素贡献率依次为：胃蛋白酶添加量>果胶酶添加量>酸性纤维素酶添加量。