野黄芩苷对血管紧张素II诱导小鼠心肌纤维化的影响

辛博 ,陈力,万丽丽,郭澄*

(1.上海交通大学附属第六人民医院，上海　200233;2.上海中医药大学，上海　201203)

野黄芩苷(Scutellarin,SCU)是从传统中草药菊科植物短茎飞蓬[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz]的干燥全草中提取的一种黄酮类单体。现有研究表明，野黄芩苷对心血管疾病有显著的药理作用，包括舒张血管、对缺血再灌注心脏和内皮细胞的保护作用、抗炎、抗凝、抗血栓、抗心律失常等[1]，但其对心肌纤维化的作用机制尚不清楚。细胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)和促分裂素原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的主要组成部分，也是心肌纤维化相关的重要通路。研究显示， ERK1/2和p38-MAPK通路可有效抑制细胞外基质分泌和心肌纤维化的发展[2]。基于此，本研究以血管紧张素II (Angiotension II,ANG II) 诱导的心肌纤维化小鼠为对象，探讨野黄芩苷对心肌纤维化及ERK1/2和p38-MAPK通路蛋白表达的影响。

1　材料

1.1　动物

6周龄雄性C57BL/6小鼠，购自上海西普尔-毕凯实验动物有限公司。动物许可证号：SCXK(沪)2013-0016。饲养于上海市第六人民医院SPF级动物房。正常饮水、饮食。适应性饲养7天后开始正式实验。

1.2　药品与试剂

Alzet植入式胶囊渗透压泵1004型(美国Alzet公司)；野黄芩苷对照品(Scutellarin，SCU，>98%，成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-16030406)；血管紧张素II (Angiotensin II，ANG II，≥93%，美国Sigma公司，批号SLBH9339V)；羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号A030-1)；SYBR qPCR Master Mix 试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号Q341-02)；p38-MAPK抗体(美国Santa Cruz 公司，批号sc-7972)；p-p38-MAPK抗体(美国Santa Cruz 公司，批号sc-166182)；ERK1/2抗体(美国Santa Cruz 公司，批号sc-514302)；p-ERK1/2抗体(美国Santa Cruz 公司，批号 sc-136521)；GAPDH抗体(杭州华安生物有限公司，批号EM1101)；IRDyeTM 800荧光二抗(美国LI-COR公司，批号C60726-02，C60716-02)；硝酸纤维素膜(美国Pall公司)。

1.3　仪器

台式高速低温离心机(美国Beckman Coulter公司)；凝胶电泳仪(美国 Bio-rad公司)；PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Odyssey 红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司)；荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。

2　方法

2.1　分组及给药

将小鼠按体质量随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组(Normal 组)，血管紧张素II模型组(ANG II 组)，血管紧张素II+野黄芩苷干预组(ANG II+SCU 组)和野黄芩苷对照组(SCU 组)。正常对照组腹腔注射生理盐水2.5 mg/(kg·d)，同时每天给予 40 mg/kg 0.5% 羧甲基纤维素钠灌胃； ANG II组皮下药物渗透泵持续滴注ANG II 2.5 mg/(kg·d)，同时每天给予40 mg/kg 0.5% 羧甲基纤维素钠灌胃；ANG II+SCU组皮下药物渗透泵持续滴注ANG II 2.5 mg/(kg·d)，同时每天给予野黄芩苷40 mg/kg灌胃；SCU组腹腔注射生理盐水2.5 mg/(kg·d)，同时每天给予野黄芩苷40 mg/kg灌胃。4周后处死小鼠，迅速取出心脏，取左室心肌组织，留取部分放入中性福尔马林溶液中制作石蜡切片，其余部分-80℃保存，备用。

2.2　Masson’s trichrome染色观察心肌组织纤维化面积

石蜡切片脱水后，按Masson染色试剂盒进行操作，倒置显微镜观察心肌组织胶原沉积程度，胶原部分呈蓝色，正常部分为红色。

2.3　心肌组织中羟脯氨酸含量检测

取心肌组织约50 mg， 按试剂盒说明书操作，测定各组心肌中HYP的含量。1)消化：取15 mL离心管，空白管、标准管和测定管分别加入0.5 mL的双蒸水，标准应用液和待测样本，同时加入0.05 mL的消化液。2)含量测定：每管加入试剂一0.5 mL，混匀，室温静置10 min;每管加入试剂二0.5 mL，混匀，室温静置5 min；每管加入试剂三1 mL，混匀，60℃水浴15 min，流水冷却后，3 500 r/min离心10 min，取上清200 μL在550 nm处测定吸光度。按公式计算各组羟脯氨酸含量。

羟脯氨酸含量(μg/mL)=(测定吸光度管-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度(5 μg/mL)×样本测试前稀释倍数

2.4　RT-qPCR 检测心肌组织中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ 和α-SMA mRNA表达

提取RNA后，取500 ng，按试剂盒说明书操作，进行逆转录和荧光定量RT-qPCR (10 μL 体系)， 测定各组心肌组织中Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA的mRNA表达水平。

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，各引物序列如下：GAPDH： forward，5′-TGA TTC TAC CCA CGG CAA GTT-3′，reverse 5′-TGA TGG GTT TCC CAT TGA TGA-3′； Col1：forward，5′-ACG TCC TGG TGA AGT TGG TC-3′，reverse，5′-TCC AGC AAT ACC CTG AGG TC-3′；Col3：forward，5′-AGG CCA ATG GCA ATG TAA AG-3′，reverse，5′-TAT TGG TGG GTG AAA CAG CA-3′；α-SMA，forward，5′-ATG ACA TGA CTG AAG CA-3′，reverse，5′-TTC TCT GTG GAG CTG AAG CA-3′。

RT-qPCR反应条件为： 95 ℃预变性30 s；之后95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；进行40个循环后对扩增产物进行溶解曲线分析。

2.5　Western blot检测心肌组织中ERK1/2和p38-MAPK蛋白的表达

称取心肌组织约50 mg于预冷的碾钵中，加入液氮碾碎成粉末状，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。依次进行聚丙烯酰氨凝胶电泳、转膜、封闭，加入ERK1/2、p-ERK1/2、p38-MAPK、p-p38-MAPK和GAPDH一抗，4℃孵育过夜，加入IRDyeTM 800荧光二抗孵育2 h，Odyssey 红外荧光扫描成像系统扫描印迹。对各组条带进行灰度分析，将各目的蛋白灰度值和内参灰度值比较，得到相对表达量。

2.6　统计学处理

3　结果

3.1　野黄芩苷减少ANG II诱导的小鼠心肌纤维化组织中胶原沉积

显微镜下可见，Normal组和SCU组心肌纤维排列整齐，呈束状，结构正常。ANG II组心肌纤维呈波浪状，排列较紊乱，且组织间质胶原含量明显增多。ANG II+SCU组心肌纤维排列较ANG II组见整齐，胶原沉积显著降低，心肌纤维化面积减少。 单独给予野黄芩苷不影响心肌结构。结果见图1。

图1　心肌组织 Masson’s trichrome染色结果注：A:Normal 组；B:ANGII 组；C:ANG II+SCU组;D:SCU 组

3.2　野黄芩苷降低ANG II诱导的心肌纤维化小鼠心肌组织中羟脯氨酸的含量

HYP含量测定结果显示(图2)，相对于 Normal组(133.2±5.50)μg/g，ANG II组心肌组织HYP的含量显著增加，为(330.7±19.18)μg/g；而 ANG II+SCU组HYP含量与 ANG II 组相比明显下降，为(182.2±10.35)μg/g，差异具有统计学意义(P<0.05)。SCU HYP含量为(109.6±7.21)μg/g，与正常对照组无显著性差异。

图2　心肌组织羟脯氨酸含量测定(n=3)注：与正常组比较，*P<0.05；与ANGII模型组比较，#P<0.05

3.3　野黄芩下调ANGII诱导的心肌纤维化小鼠心肌组织中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ 和α-SMA mRNA表达

为了进一步证明野黄芩苷的抗心肌纤维化作用，我们利用RT-qPCR检测ANGII诱导的纤维化小鼠心肌组织中纤维化相关基因mRNA水平的变化情况，结果如图3所示。以Normal组的mRNA表达水平为基值1，在ANGII模型中，CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA的mRNA表达水平显著上升(P<0.05)；而相较于模型组，野黄芩苷能够降低心肌纤维化组织中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和α-SMA的mRNA表达水平(P<0.05)。说明野黄芩苷能够抑制心肌纤维化相关基因的表达，表现出抗心肌纤维化的作用。

图3　野黄芩对ANG II诱导的心肌纤维化小鼠心肌组织中Collagen I，Collagen Ⅲ和α-SMA mRNA 水平的影响注：与正常组比较，*P<0.05；与ANGII模型组比较，#P<0.05

3.4　野黄芩对ANGII诱导的心肌纤维化小鼠心肌组织中p-ERK1/2和p-p38 MAPK蛋白表达的影响

与Normal组相比较，ANGII模型组p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白表明显升高，给予野黄芩苷干预后，p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白表达显著降低。SCU单独给药组与Normal组p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白无显著差别。各组ERK1/2和p38-MAPK总蛋白表达无明显变化。结果见图4。

图4　Western blot检测各组心肌组织中p-ERK1/2(A)和p-p38 MAPK(B)蛋白表达

4　讨论

心肌纤维化是以细胞外基质过度沉积造成心脏顺应性下降为主的一种复杂的病理生理过程。心肌纤维化的发病机制与多种因素相关，如肾素-血管紧张素-醛固酮系统，炎症因子，生长因子TGF-β、PDGF等[3]。本研究采用皮下植入胶囊渗透压泵的方法，连续4周持续滴注ANG II。Masson’s trichrome病理切片结果显示，小鼠心肌间质胶原含量显著增多，出现心肌间质纤维化现象。ANGII组小鼠心肌组织中HYP含量增加，同时纤维化相关基因CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA mRNA表达均较正常对照组上调，说明ANGII诱导了小鼠心肌纤维化的发生。

中医药可以通过调节心血管活性物质而改善心肌纤维化[4-7]。大量研究表明单味中药和中药单体提取物如苦参碱、钩藤碱、葛根素、姜黄素等可有效抑制心肌纤维化的发生发展[8]。中草药菊科植物短茎飞蓬[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz]的干燥全草在临床上常用来治疗心脑血管疾病，其主要有效成分即为野黄芩苷。目前野黄芩苷对心脏作用的研究主要集中在其对心肌细胞保护作用方面[9-13]，与纤维化相关的研究较少。Zhou H 研究显示，野黄芩苷可有效抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞Epithelial-mesenchymal transition(EMT)过程[14]。本研究发现，小鼠连续4周给予野黄芩苷40 mg/kg灌胃后，心肌间质胶原含量显著性下降，同时羟脯氨酸和CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA基因mRNA表达水平也明显降低。说明野黄芩苷可有效抑制ANGII诱导的小鼠心肌纤维化发生。

ERK1/2和p38-MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中主要的成员，调控细胞的生长、增殖、分化和炎症应答等多种重要病理生理过程。研究显示，ERK1/2及p38-MAPK通路的激活与心肌纤维化的发生密切相关[15]。有报道证实ERK1/2及p38-MAPK的抑制剂可有效抑制心肌梗死造成的大鼠心肌纤维化[16]。本研究结果表明，ANGII可激活心肌中ERK1/2和p38-MAPK通路，使其磷酸化水平显著增加，而野黄芩苷能够抑制ERK1/2和p38-MAPK磷酸化蛋白的表达，提示野黄芩苷可能通过抑制ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化发挥功能，从而抑制心肌外基质的沉积和心肌纤维化发展。

综上所述，本研究初步探讨了野黄芩苷对ANGII诱导的小鼠心肌纤维化影响作用，为中医药抗心肌纤维化新药的研发提供了有利的参考。