功能化磁性荧光复合纳米粒子的制备及其作为双功能造影剂的应用

褚建祎，陈莹

(1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000；2.31697部队，辽宁 大连 116000)

在临床诊断过程中，对早期病变患者的病理信息诊出率不足，获取的信息单一，可能导致治疗策略的遗漏或失误；另在治疗过程中，复杂手术环境下对病灶和正常组织难以实现精准区分定位，以及无法及时获取形变状态，都导致了治疗方法与范围的误差，降低手术成功率与预后效果。这种种的临床需求都迫切地要求临床的诊断方式要从过去的相互独立、单一化向一体化、多样化趋势发展[1]。磁共振成像技术(Magnetic Resonance Imaging，MRI)作为临床医学影像诊断方面最常用手段具有三维高质量软组织成像，高空间分辨率和无放射性损伤等优点，但是其灵敏度较差，很难发现较小的病灶[2-3]。而荧光成像(FluoresenceImaging/FI)具有极高的灵敏度，可以在手术和治疗过程中提供实时清晰的成像，但是其空间分辨率较差，穿透性不足。因此将MRI与FI两种成像模式结合，便可提供充足和完整的医学信息，为临床诊断和治疗提供依据。

二氧化硅由于其出色的理化性质，如良好的水溶性、高的透光性、化学惰性、以及表面容易修饰基团可用于连接多种生物分子等，引起了人们广泛地关注。随着纳米技术的发展，近几年，硅包覆QDs和Fe3O4的复合粒子(Fe3O4-QDs/SiO2)的合成及应用已成为了多功能磁性荧光复合纳米粒子的研究热点之一[4]。本文拟利用反相微乳法制备超小Fe3O4-QDs/SiO2复合纳米粒子，由于Fe3O4-QDs/SiO2复合纳米粒子兼具出色的荧光和磁性信号，并能够有效地防止量子点等纳米粒子的泄露等优点，因此其作为造影剂可同时用于高空间的MRI和高灵敏的FI的双模态成像。

1　材料与方法

1.1仪器与试药硼氢化钠、碲粉(99.99%)、氯化镉、巯基丁二酸(MSA)、六水合三氯化铁、四水合二氯化铁、四甲基氢氧化铵(TMAH)、曲拉通X-100、正己醇、聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐、四甲基硅烷络合物等均购买于Sigma-Aldrich公司，纤维素透析袋(截留分子量：5000)及尼龙超滤膜(孔径：0.2 μm)购买于Spectrum Labs公司。Fe3O4-QDs/SiO2纳米粒子的形貌和尺寸通过FEI Tecnai G2型透射电子显微镜进行观察。将制备好的纳米粒子的悬浮液超声分散后，取一滴滴于铜网上，自然干燥。Hitachi U4100 UV Spectrometer紫外光谱仪和F-2700荧光分光光度计用于记录Fe3O4-QDs/SiO2纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱。振动样品磁强计用来机率Fe3O4-QDs/SiO2纳米粒子的磁化强度，同时Magnetom Verio 3.0 TMRI 扫描仪(Siemens，德国)对Fe3O4-QDs/SiO2纳米粒子进行体外MRI成像研究。

1.2方法

1.2.1水相CdTe量子点的合成采用水热法合成水相CdTe量子点。称取80 mg 的硼氢化钠，将其放于一个通氮除氧后的密闭小烧瓶中，然后向其中加入1 mL的去离子水，再加入127.5 mg的碲粉。在小烧瓶上方留一可以排气的小孔，以便排除反应所产生的氢气。在常温下电磁搅拌反应4 h，产生白色的NaHTe中间体。按照摩尔比Cd2+/MSA/NaHTe=1∶2.4∶0.5的比例，将NaHTe溶液加入到通氮去氧后、混有巯基丁二酸(MSA)的CdCl2溶液中。然后将混合溶液加入到反应釜中，在160 ℃下反应45 min，制备出最大发射波长为635 nm，摩尔浓度为2 mM，巯基丁二酸修饰的CdTe量子点。

单分散的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子由化学共沉淀法制备，首先将六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)，四水合二氯化铁(FeCl2·4H2O)按照摩尔比Fe3+∶Fe2+=2∶1加入到已通N230 min的盛有100 mL水的三颈瓶中。保持通N2 并剧烈搅拌，此时缓慢加入12 mL氨水(25%)。30 min后，停止反应，用磁铁将黑色的Fe3O4生成物从水溶液中分离，用蒸馏水反复洗涤3次。然后加入适量的四甲基氨TMA对四氧化三铁进行修饰，超声1 min，摇匀，分散在10 mL去离子水中备用。最终所制备的Fe3O4纳米粒子浓度约为10 mM。

1.2.2制备Fe3O4-CdTeQDs/SiO2复合纳米粒子Fe3O4-CdTeQDs/SiO2复合纳米粒子是在室温下由反相微乳法制得。在合成过程中，环己烷作为连续相，曲拉通X-100作为表面活性剂和正己醇作为助表面活性剂。当水相的CdTe和Fe3O4纳米粒子加入后，搅拌形成微乳液(W/O)体系，在碱性条件下，正硅酸乙酯TEOS在油水界面进行水解，从而将水相的CdTe和Fe3O4纳米粒子包覆在二氧化硅壳中。在本实验中，将7.5 mL环己烷，1.77 mL曲拉通X-100，1.8 mL正己醇，100 μL合成的Fe3O4纳米粒子溶液，400 μL CdTe量子点水溶液，60μL聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐PDDA 水溶液(0.075% v/v)和100 μL的TEOS混合，搅拌30 min，形成均匀的微乳液体系。然后将60 μL浓度为28%的NH4OH加入到微乳液体系中，在碱性条件下，TEOS开始水解反应。室温下，避光反应24 h后，20 mL丙酮溶液加入到锥形瓶中进行破乳，即所得Fe3O4-CdTeQDs/SiO2复合纳米粒子。最后，分别用异丙醇，乙醇，水清洗复合纳米粒子。

1.2.3功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子稳定性测试将制备的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子溶于pH=7.4的PBS溶液中，将其置于室温下进行放置，利用动态光散射仪分别对1、3、5、7、14、21 d时对溶液中纳米粒子的水合离子半径进行测量，反映功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2纳米粒子的聚集状态，从而检验纳米粒子的稳定性。

1.2.4MRI成像配置不同浓度的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子，按照铁离子浓度分别为0.02、0.05、0.1 mM，同时用水做对照剂。利用Magnetom Verio 3.0 T MRI 扫描仪对样品进行MRI的T2加权成像。

2　结　　果

2.1功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的形貌与性质分析

功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的形貌与粒径可通过TEM 进行观察，如图1所示。功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的形态规则，粒径均匀分布，二氧化硅成功地包覆了Fe3O4和CdTeQDs纳米粒子具有明显的核壳结构，呈球形，大小约为50 nm 左右。有较强的尺寸优势和高的表面积。另外，通过氨基化硅烷络合剂，使其表面成功连接活性的氨基基团，使其保持活性可以与多种生物分子进行相连，且具有极好的水溶性。

另通过激光粒度仪对其稳定性的研究表明(见图2)，Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的水合半径，在室温及普通光照下，能够稳定存在超过2 w。在测定期间内，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的水合半径没有明显变化，表明表面氨基修饰能够有效的防止纳米粒子因表面积造成的团聚，显示了较好的稳定性。

图1　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2纳米粒子的电子透射电镜TEM成像图2　室温下不同时间内功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2纳米粒子水合离子半径检测

2.2功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的荧光和超顺磁性性质分析

功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的荧光发射光谱如图3所示，从图中可以看出，Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子发射波长在653 nm，且显示了杰出的荧光性质，较大的Stock’s位移和窄而对称的发射光谱，这使其作为一种FI造影剂在生物医学领域上可提供事实的高灵敏的荧光成像，具有广泛而深远的应用前景。另通过磁滞回线(见图4)可以看出Fe3O4-CdTeQDs/SiO2具有较好的超顺磁性和可忽略的剩磁与矫顽力。其饱和磁强比达到了20.1 emu/g，显示了较好的超顺磁性，这为其作为T2加权MRI造影剂奠定了理论基础。

图3　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2纳米粒子的荧光光谱图4　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2纳米粒子的磁滞回线

2.3功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的体外T2加权MRI成像

磁共振显影剂是磁共振成像的基础，造影剂的使用，可有效地改变病变组织中质子的自旋-自旋弛豫时间，从而有效地增强对比度。不同浓度的功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子的体外T2加权MRI成像如图5所示。T2加权MRI成像的使信号值的逐渐减弱显暗色，其中作为对照剂，水的信号强度很高，对应的T2加权MRI 成像呈亮色，这与水分子的反磁性性质相对应。而作为造影剂，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子溶液的 MRI 图像显暗色，对应的造影强度与其浓度表现出明显的依靠关系，随着浓度逐渐增大，对比的MRI成像暗度增加，信号逐渐减弱。这说明制备的功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子作为T2加权造影剂可以明显缩短纵向驰豫时间T2，并随着功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子浓度的增加缩短显著。

图5功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2纳米粒子的体外T2加权MRI成像

3　讨　　论

随着纳米技术的发展，基于磁性Fe3O4纳米粒子和荧光探针的磁性荧光复合纳米粒子收到了广泛地关注。作为一种新型的多功能双模式造影剂(Contrast agents)，其不仅具有磁性纳米粒子的磁靶向、传递、细胞分离、MRI等特性，同时将荧光示踪特性融入其中，可以用作荧光基础的生物标记和荧光成像。将FI与MRI相结合，可提供更加立体和清晰的医学成像，更深一步为重大疾病早期诊断和手术提供依据和帮助。有报道称，在不远的未来，结合了磁性和光学特性的复合纳米粒子将使生物医学研究取得重大突破[5]。到目前为止，Fe3O4与多种有机荧光染料联合共同用于MR/FI 双模式成像已经有过报道[6-7]，但由于有机染料易光漂白和不稳定，导致这些双成像造影剂的应用受到很大限制。荧光量子点(Quantum dots/QDs)作为新一代的荧光探针，由于其独特的光学尺寸依赖特性、宽的激发波长、窄的发射光谱、出色的光稳定性和抗光漂白性，已经在在分子标记、免疫分析、生物成像、离子检测等方面得到了广泛的应用[8]。对于磁性荧光复合纳米体系的制备和应用，ShiDL研究组曾用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包覆磁性聚苯乙烯微球和QDs制备了多功能的纳米体系[9]；Zhang HX 研究组制备了壳聚糖包覆QDs和Fe3O4的纳米凝胶，在其表面修饰了叶酸分子后，对其在人肺癌细胞A549内的毒性、细胞成像、靶向给药及在小鼠内的磁靶向聚集等性能进行了考察[10]。Sun JQ教授等人用聚烯丙胺盐酸盐与葡聚糖的聚微凝胶包覆磁性Fe3O4纳米粒子，并通过化学键连接CdTe QDs量子点，制备了复合的磁性荧光纳米体系[11]。在上述方法中，均直接使用聚合物材料对Fe3O4及QDs进行包覆，这导致了当复合纳米粒子用于细胞或活体成像时，随着造影剂在体内的聚集和循环，QDs及Fe3O4纳米粒子很容易从复合纳米粒子中泄露出来，从而对周边细胞及组织产生毒性(如量子点泄露会产生游离的重金属离子，造成的重金属中毒)，故上述已报到的磁性荧光复合纳米粒子在生物医学应用受到很大的限制。

为了解决上述问题，本文通过反相微乳法一步制备了功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子，通过系统地研究表明，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子具有杰出的分散性，核壳结构，稳定性和较强的荧光和超顺磁性，由于表面的二氧化硅的包覆可以有效地避免QDs及Fe3O4纳米粒子泄露给生物体环境所带来的影响。通过体外的T2加权MRI成像，证明了我们所制备的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2纳米粒子可以作为一种出色的造影剂用于未来的MRI/FI成像研究。