红景天苷对力竭大鼠心肌收缩力的影响

齐江莉，李泱，解亚楠，曹雪滨

适当负荷运动可促使心脏发生重塑，表现为心肌毛细血管密度增加，心肌纤维增粗，心肌收缩力增强，心功能储备充足[1-3]。然而，超负荷运动，如力竭运动，超出了人类和动物的生理极限，可破坏机体稳态，导致机体多脏器产生过度应激反应，进而出现损伤及功能异常[4]。近年来，在军事训练及竞技比赛中，运动性心脏损伤呈增加的趋势[5]。因此，研究力竭运动引起心脏损伤的机制及其防治措施具有重要的临床意义[6]。根据药理学及临床疗效观察，红景天苷(salidroside，Sal)作为红景天的有效成分之一，对心血管具有很强的保护作用，可以改善心肌缺血，减少心肌缺血梗死面积，改善心功能，对冠心病、心力衰竭、高血压等均有辅助治疗作用[7-9]。但是，红景天苷对力竭运动后心肌细胞收缩力的影响及其机制尚缺乏研究。本研究建立力竭运动大鼠模型，观察力竭运动对心肌收缩力的影响，同时探讨红景天苷防治力竭运动心脏损伤的作用及机制，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 99%红景天苷粉剂购自上海英轩生化试剂有限公司，Ⅱ胶原酶、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自美国Sigma公司；乙二醇四乙酸(EGTA)购自美国Fluka Biochemika公司；其他试剂均为分析纯。Tyrode液(mmol/L)：NaCl 135、KCl 5.4、CaCl21.0、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、葡萄糖10，用NaOH调节pH值至7.3；无钙Tyrode液为Tyrode液中不加CaCl2。细胞保护液(KB液，mmol/L)：KOH 110，牛磺酸(Taurine)10，L-谷氨酸(L-Glutamic acid)70，KCl 25，KH2PO410，EGTA 5，HEPES 5，葡萄糖10，用KOH调节pH值至7.4。

1.2 主要仪器 Langendorff灌流装置、可视化单细胞动缘探测系统(美国IonOptix)、电子刺激器(SEN27103，美国IonOptix)、激光扫描共聚焦显微镜(SP5，德国Leica)。

1.3 实验动物分组、给药及造模 健康雄性清洁级SD大鼠40只，体重120～150g，由斯贝福生物技术有限公司提供(许可证号：SCXK 2016-0002)。实验前适应性喂养1周，然后将大鼠随机分为4组：对照组，力竭组(REE)，红景天苷A、B组(Sal-A、Sal-B)，每组10只。Sal-A组、Sal-B组分别腹腔注射红景天苷溶液15、30mg/(kg·d)，连续2周；对照组、REE组给予等体积0.9% NaCl注射液，连续2周。给药完成后，对照组不做任何运动，REE组、Sal-A组、Sal-B组进行反复力竭游泳运动。

依据Thomas实验的方法[10]，通过力竭游泳运动建立运动性心脏损伤动物模型。选择高70cm，最大直径55cm的塑料圆桶作为大鼠游泳槽，水深55cm以上，内壁光滑，水温33±2℃。大鼠尾部负重3%负荷。每次运动后，迅速用干毛巾擦除水分，电暖风机吹干动物皮毛，置于笼中休息。每次游泳时间不少于6h，较短时间出现力竭表现的大鼠，可将其捞出休息5～10min，随后放入水中继续游泳，直至时间达6h以上。力竭游泳运动共进行14d，1次/d，每周休息1d，于最后一次力竭游泳运动后2h腹腔注射肝素150U/100g，20min后10%水合氯醛1ml/100g麻醉，然后将大鼠仰卧位固定于实验台上，迅速开胸取出心脏分离心肌细胞。力竭标准：大鼠连续3次沉入水底，每次超过10s，不能自主浮上水面；同时观察大鼠身体状况，当出现协调运动丧失、放在平面上无法完成翻正反射时即从水中捞出。

1.4 ELISA法检测心肌损伤标志物水平 按照ELISA试剂盒说明检测各组大鼠血清中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(TnI)水平，酶标仪检测450nm处吸光度(OD)值。

1.5 大鼠单个心室肌细胞分离 上述各组大鼠，经10%水合氯醛(2ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速取出心脏，在37℃和通氧条件下行Langendorff灌流。用无钙Tyrode's液(流速8ml/min)灌流3～5min，用含Ⅱ型胶原酶30mg、胰蛋白酶5mg的无钙Tyrode's液50ml灌流15～18min进行消化，剪碎后置入细胞保护液(KB液)中并吹打使细胞脱落，并于4℃保存，1h后进行实验。

1.6 IonOptix单细胞动缘探测系统同步监测心肌细胞钙瞬变和收缩 将心肌细胞与Ca2+荧光染料FLUO-4于10ml离心管中混匀，在避光条件下摇床孵育20min，弃上清，重新加入KB液，洗去细胞外多余的钙荧光指示剂。利用IonOptix系统检测荧光染料所发出的信号以反映收缩过程中Ca2+浓度的变化。取适量的心肌细胞置于IonOptix系统的浴槽内，采用正常台式液以1.5ml/min的速度灌流。设置电场刺激为电压15V，频率1Hz。实验开始前，首先转换低倍物镜以选定视野中边界分明、横纹清楚、收缩协调的心肌细胞作为记录对象，然后转换高倍镜，将选定的细胞于视野中放大。给予刺激后若细胞收缩稳定，则开始同步记录钙瞬变和细胞收缩。两者通过照相系统将光信号呈现于显示器，并由计算机系统采集及记录。

1.7 激光共聚焦显微镜线扫描成像技术记录心肌细胞自发性钙火花及肌质网Ca2+含量 钙火花：荧光指示剂处理细胞同钙瞬变和收缩的检测。不同之处是上机前将细胞移至层粘连蛋白(laminin)贴壁处理过的细胞皿中，细胞外液为含钙台式液。将荧光指示剂孵育完毕的心肌细胞置于显微镜载物台，选取视野中横纹清楚、收缩稳定的杆状细胞作为记录对象。共聚焦显微镜以线扫描(xt)成像，在线扫描之前需采用平面(xyt)扫描得到细胞的范围，随后调节选取荧光指示剂分布均匀的平面，然后将扫描线置于选定平面的中央，转换成线扫描方式，同时刺激细胞记录心肌细胞钙火花。肌质网钙容量：咖啡因(caffeine)可以激动兰尼碱受体(ryanodine receptor，RyR)，使其开放，选用浓度为20mmol/L的咖啡因作用于RyR，以确保肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)内的钙全部清空。心肌细胞负载染料完成后置于浴槽内，选取横纹清楚、边界清晰的杆状细胞，待其收缩稳定后，于其旁边给予咖啡因以刺激RyR，RyR完全处于开放状态后引起肌质网内钙迅速全部释放，此时钙瞬变峰值达到最大，可以反映肌质网钙容量。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌损伤标志物水平检测 REE组TnI、CK和CK-MB水平均高于对照组，给予Sal后，TnI、CK和CK-MB水平均下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，且Sal-B组较Sal-A组下降更为明显(P＜0.05，表1)。

表1 4组大鼠心肌损伤标志物水平比较(±s，n=10)Tab.1 Comparison of heart injury serum markers between the four groups (±s, n=10)

表1 4组大鼠心肌损伤标志物水平比较(±s，n=10)Tab.1 Comparison of heart injury serum markers between the four groups (±s, n=10)

REE. Exhaustive group; Sal-A. Salidroside A group; Sal-B.Salidroside B group. Same as below. CK.Creatine kinase; CK-MB.Creatine kinase isoenzyme; TnI. Troponin I. (1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.01 compared with REE group; (3)P＜0.05 compared with Sal-A group

Group CK(ng/ml) CK-MB(ng/ml) TnI(pg/ml)Control 27.23±2.11 12.07±0.35 85.13±20.33 REE 41.32±1.56(1) 14.87±0.62(1) 147.64±10.24(1)Sal-A 37.03±2.35(2) 13.68±0.33(2) 121.37±21.68(2)Sal-B 35.67±2.74(2)(3) 13.03±0.25(2)(3) 111.71±16.39(2)(3)

2.2 红景天苷对反复力竭大鼠心肌细胞收缩及钙瞬变的影响 在对照组细胞中，钙瞬变的平均幅度(ΔF/F0)为2.78±0.12，且细胞收缩最大幅度百分比为9.72%±0.22%。反复力竭运动后，大鼠心肌细胞钙瞬变及最大收缩幅度分别降低41%和45%(P＜0.01)；与REE组相比，Sal-A、Sal-B组细胞收缩和钙瞬变的振幅均增加，细胞收缩幅度增加了25%和54%，而钙瞬变增加了20%和38%；与Sal-A相比，Sal-B组钙瞬变及最大收缩幅度增加更明显(P＜0.01，图1、2)。

图1 各组大鼠心肌细胞收缩幅度的比较Fig.1 Comparison of contraction amplitude of myocardial cells in each group

图2 各组大鼠心肌细胞钙瞬变的比较Fig.2 Comparison of calcium transient in rats' myocardial cells in each group

2.3 红景天苷对反复力竭大鼠心肌细胞钙火花及肌质网钙容量的影响 对照组大鼠心肌细胞钙火花的发生频率为1.70±0.10/(100μm·s)，大鼠经过反复力竭游泳运动后，心肌细胞的钙火花频率增加了1.5倍(P＜0.01)。Sal-A、Sal-B组钙火花频率分别为3.20±0.10、2.60±0.30/(100μm·s)，与REE组相比均明显降低(P＜0.01)，且Sal-B组较Sal-A组降低更明显(P＜0.01，图3)。REE组咖啡因诱导的钙瞬变，即肌质网钙库含量(2.51%±0.10%)与对照组(3.97%±0.20%)相比明显降低(P＜0.01)；Sal-A、Sal-B组肌质网钙库含量(分别为3.06%±0.15%、3.30%±0.17%)与REE组相比明显升高，且Sal-B组升高更为明显(P＜0.01，图4)。

图3 各组大鼠心肌细胞舒张期钙火花的比较Fig. 3 Comparison of calcium sparks during diastolic phase of myocardial cells in each group

图4 各组大鼠心肌细胞肌质网钙库含量的比较Fig. 4 Comparison of sarcoplasmic reticulum calcium pool contents of rats' myocardial cells in each group

3 讨 论

早期研究认为，力竭运动引起的心脏损伤与心律失常有关，超负荷运动致心律失常一直是运动医学、军事医学领域关注的问题。已有确切研究证据证实，力竭运动可引起窦房结功能障碍、心脏传导系统异常、折返激动等心脏病理状态，从而导致窦性心律不齐、期前收缩、房颤等多种心律失常[11-14]。但近年来的研究发现，超负荷运动也会出现心力衰竭型心脏损伤[15]。心力衰竭是指心肌细胞收缩力减弱，导致心脏泵血功能障碍，超声检查提示左心室射血分数降低。心脏收缩功能的减退对力竭运动引起心脏损伤的机制提供了新的研究方向。心肌收缩力减弱的发生与心肌细胞内Ca2+循环的异常密切相关[16]。因此深入研究心肌细胞收缩过程中的Ca2+循环对阐明力竭运动引起心衰型心脏损伤具有重要意义。

本研究发现，与对照组相比，力竭组大鼠心肌细胞收缩过程中钙瞬变峰值降低，收缩力减弱。众所周知，在心肌细胞收缩过程中，钙诱导钙释放(Ca2+induced Ca2+release，CICR)引起胞质内Ca2+浓度瞬间明显增加，即钙瞬变，胞质内瞬时增加的高浓度Ca2+与肌钙蛋白结合，通过肌丝滑行引起心肌收缩[17]。故钙瞬变与心肌细胞收缩直接相关，钙瞬变峰值的高低决定了心肌细胞收缩力的强弱。另一方面，本研究通过激光共聚焦显微镜线扫描成像技术记录了心肌细胞舒张期产生的钙火花频率及肌质网Ca2+含量，结果发现，与对照组相比，力竭大鼠心肌细胞舒张期钙火花频率增加，相应的肌质网内Ca2+含量减少。首先，Ca2+在舒张期通过许多局部短暂的Ca2+释放事件漏出肌质网，即所谓的“钙火花”。过度的Ca2+由肌质网漏至胞质，可导致肌质网的Ca2+含量降低，此外，在CICR过程中肌质网为钙瞬变提供了约92%的Ca2+[18]，故肌质网内Ca2+含量对钙瞬变起决定性作用。虽然肌质网钙泵(sarcoplasmicreticulum Ca2+-ATPases，SERCA2a)功能受损和钠钙离子交换体(Na+/Ca2+exchanger，NCX)活性增强也被认为是肌质网Ca2+负载降低的原因[19]，但最新研究指出，舒张期肌质网Ca2+通过RyR2病理性泄漏是影响心力衰竭中钙稳态的主要原因[20]。综合上述结果，心肌舒张期Ca2+泄漏导致肌质网内Ca2+储备量不足，直接影响收缩期钙瞬变的能力，使钙瞬变峰值下降，最终导致心肌细胞收缩力减弱。Belevych等[21]也指出，自发性钙火花介导的舒张期肌质网Ca2+泄漏，对肌质网钙含量有很重要的影响。此外，Santiago等[22]在研究心力衰竭时发现，大鼠心肌细胞在舒张期Ca2+泄漏增多，肌质网内Ca2+含量降低，故认为舒张期Ca2+泄漏是心肌收缩力减弱的关键。本实验心肌细胞舒张期Ca2+过度泄漏导致心肌收缩力减弱的现象与其他学者对心衰动物模型钙稳态失衡的研究结果一致[23-24]。

随着中药现代化进程的不断推进，越来越多的中药及其复方被应用于力竭心脏损伤的保护研究中。本研究发现，红景天苷可抑制力竭大鼠心肌细胞舒张期过度的Ca2+以钙火花的形式自肌质网漏至胞质，从而抑制舒张期肌质网内Ca2+含量减少，最终导致钙瞬变增强，心肌收缩力增强。本研究表明，红景天苷能改善力竭运动引起的心肌细胞收缩力减弱，其机制可能与细胞内Ca2+稳态的调控有关。多项研究表明，红景天苷可通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等多种途径对心脏损伤发挥保护作用[25-26]。Zhu等[27]研究证实，红景天苷对急性心肌缺血和心脏缺血/再灌注损伤有良好的保护作用，可以改善心肌缺血，减少心肌缺血梗死面积。Zou等[7]指出，红景天苷可能通过抑制舒张期肌质网和线粒体内储钙的释放来抑制钙超载的发生，对细胞内钙稳态具有调节作用。

力竭运动作为应激原之一，其造成的心肌损伤不仅是部队战斗力下降和非战斗性减员的重要原因之一，而且是运动医学所面临的重大难题。因此，有必要对力竭运动导致的心肌损伤进行细致深入的研究，以进一步揭示内在机制，为力竭运动应激的防治提供新方法。红景天苷作为中草药，对心血管的保护具有多靶点、多环节、多途径干预等优势[8,28]，本研究结果为红景天苷改善力竭运动造成的心肌收缩力减弱提供了科学依据，为红景天苷的临床应用推广提供了参考。

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