响应面法优化桤叶唐棣果酒发酵工艺的研究

曹丽娟，张卓睿，王 傍，薛艳丽，毛迪锐，孟庆繁，姜贵全*

（北华大学 林学院，吉林 吉林 132013）

桤叶唐棣（Amelanchier alnifoliaNutt）是蔷薇科唐棣属落叶植物[1]，果实中钙含量高（88 mg/100 g鲜果），也称高钙唐棣[1-2]，其所含营养成分与蓝莓非常相似，具有抗氧化[3-4]、降血糖[5]、降血脂[6]、预防癌症[7]等功效。

果酒是将水果经酵母菌发酵而制得的一类低度饮料酒[8-9]，富含氨基酸、多糖、多酚、维生素等成分[10-11]，同时，由于在酿造过程形成了醇类、醛类、酯类等物质，也赋予了果酒一些原料所不能及的营养及风味，具有较好的保健作用，可起到控制胆固醇、促进血液循环、调节新陈代谢、抗衰老、美容养颜等功效[12-13]。近年来，随着人们保健意识的增强，果酒需求量逐年增大，因此，研发一些新产品以丰富果酒市场、满足不同消费需要已成为研究的新热点[14]。桤叶唐棣果实为梨果状浆果，呼吸强度高，耐贮性较差[15]，而目前国内对其果实的加工能力不足，产品品种少，贮运技术不完善，造成了资源的浪费。所以，本试验将桤叶唐棣发酵酿制成一种含钙果酒，不但符合果酒市场的发展趋势，满足当代人群对补钙食品的需求，而且可以减少桤叶唐棣果实在运输、贮藏过程中的损耗，提高原料附加值，对促进其开发利用起到积极的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

安琪果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（食品级）：市售；亚硫酸氢钠、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

桤叶唐棣：采于吉林蛟河林场，清洗后冷冻贮藏。

1.2 仪器与设备

HH-2数显恒温水浴锅：江苏省金坛市科技仪器有限公司；LDZX-40Ⅱ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；RHB80手持式糖量折光仪：泰斯特仪器有限公司；SPX-2500S-Ⅱ型生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桤叶唐棣果酒制作工艺流程

1.3.2 操作要点

原料预处理：选择无病虫害、无霉烂腐烂、成熟度好的桤叶唐棣果实，清洗、沥干后，将唐棣果充分破碎。

成分调整：将唐棣果浆调整至最适糖度，并添加亚硫酸氢钠（以SO2计65～80 mg/kg）。

灭菌：将调整成分后的果浆在80℃条件下加热15～20 min，以达到灭菌及灭酶的效果。

活化酵母：按1∶10将果酒酵母和3%蔗糖溶液混合，轻微搅拌后，35℃下保温25 min[16]。

发酵：按最佳工艺条件，向唐棣果浆中加入0.06%活化酵母，搅拌均匀后，25℃发酵12 d。

过滤与陈酿：用200目滤布将发酵好的唐棣果酒过滤，然后在18～20℃陈酿2个月。

巴氏杀菌：陈酿后果酒在70～75℃保持15～20 min。

1.3.3 发酵工艺优化单因素试验

以酒精度为主要评定指标，分别考察发酵温度（18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃），酵母接种量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%），初始糖度（12%、14%、16%、18%、20%、22%），发酵时间（5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）对桤叶唐棣果酒发酵的影响。

1.3.4 响应面试验优化发酵工艺

在单因素试验基础上，固定桤叶唐棣果浆初始糖度为22%，以酵母接种量（A），发酵温度（B），发酵时间（C）为考察因素，以酒精度（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计[17]，以优化发酵工艺。因素与水平编码见表1所示。

表1 发酵工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 果酒品质分析

（1）感官指标

表2 桤叶唐棣果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards ofAmelanchier alnifoliafruit wine

参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中感官分析设计评分方法对桤叶唐棣果酒进行感官评价，满分为100分，感官评分标准见表2。

（2）理化指标

酒精度：酒精比重计法[11]；糖度：折光计法[11]；总糖（以葡萄糖计）测定：直接滴定法[18]；钙的测定：原子吸收分光光度法[19]。

（3）微生物指标

菌落总数、大肠杆菌及致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）按GB/T 4789.25—2003《食品卫生微生物学检验酒类检验》的规定执行[20]。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对桤叶唐棣果酒的影响

调整桤叶唐棣果浆初始糖度为18%，接入0.06%活化后酵母，分别于18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃条件下恒温发酵7 d，测得酒精度如图1所示。

图1 发酵温度对桤叶唐棣果酒酒精度的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content of Amelanchier alnifoliafruit wine

由图1可知，随着发酵温度的升高，产品酒精度先逐渐增大，当发酵温度为24℃时，果酒酒精度达到最大值为9.2%vol；之后继续升高发酵温度，酵母衰老加速，活性受到抑制，酒精度开始缓慢下降，而且所得果酒逐渐呈现出苦味，口感变差。因此，确定适宜的发酵温度为24℃。

2.2 酵母接种量对桤叶唐棣果酒的影响

调整桤叶唐棣果浆初始糖度为18%，分别按0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%接入活化后酵母，于24℃恒温发酵7 d后，测定各试验点酒精度，结果如图2所示。

由图2可知，随着酵母接种量的增加，酒精度先快速升高，当接种量为0.06%时，果酒酒精度达到最大值9.9%vol，之后继续增加接种量，由于果浆中糖分过多的用于酵母菌的生长繁殖，反而不利于发酵，酒精度开始下降，同时酒体含糖下降，酸度升高，口感变差。因此，选择适宜的酵母接种量为0.06%。

图2 酵母接种量对桤叶唐棣果酒酒精度的影响Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content of Amelanchier alnifoliafruit wine

2.3 初始糖度对桤叶唐棣果酒的影响

分别调整桤叶唐棣果浆初始糖度为16%、18%、20%、22%、24%、26%，接入0.06%活化后酵母，于24℃恒温发酵7 d后测定酒精度，结果如图3所示。

图3 初始糖度对桤叶唐棣果酒酒精度的影响Fig.3 Effect of initial sugar content on alcohol content of Amelanchier alnifoliafruit wine

由图3可知，随着初始糖度的升高，酒精度先增加后减小，当初始糖度为22%时，果酒酒精度达到最大值11.8%vol；当初始糖度高于24%以后，过高的渗透压会抑制果酒酵母的活性，不利于发酵，酒精度开始下降，而且过多的糖分会导致产品口感偏甜，降低果酒的品质。因此，选择适宜初始糖度为22%。

2.4 发酵时间对桤叶唐棣果酒的影响

调整桤叶唐棣果浆糖度为22%，接入0.06%活化后酵母，于24 ℃分别发酵5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d后测定酒精度，结果如图4所示。

由图4可知，随着发酵时间的延长，果酒酒精度呈先增加后略降低的趋势，当发酵时间为11 d时，果酒酒精度达到最大值13.2%vol，此时酒香协调，口感较好；之后再延长发酵时间，产品酒精度和口感变化不大，适于陈酿。因此，选择适宜的发酵时间为11 d。

图4 发酵时间对桤叶唐棣果酒酒精度的影响Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content of Amelanchier alnifolia fruit wine

2.5 响应面试验优化发酵工艺

以酵母接种量（A），发酵温度（B），发酵时间（C）为考察因素，以酒精度（Y）为响应值，进行响应面试验设计，试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 发酵工艺优化响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization

利用Design-Expert 8.0.6软件对表3中的试验结果进行回归拟合，得到桤叶唐棣果酒的酒精度（Y）对应酵母接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）的回归方程为：

由表4可知，回归模型检验P＜0.000 1，表明方差分析所建数学模型极显著，在统计学上是有意义的；失拟项检验P=0.668 1＞0.05，差异不显著，说明试验结果受未知因素干扰小，可用回归方程代替真实点对试验结果进行分析；变异系数（coefficientofvariation，CV）＝1.45%值较低，表明试验精确度较高，结果真实可靠[21]；精密度为20.301＞4，表明方程的可信度较高[17]；决定系数R2=0.984 2，表明方程的拟合度较好[17]。综上所述，可确定所得回归方程能用于优化桤叶唐棣果酒的发酵工艺。

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

根据回归方程一次项系数绝对值的大小，可知影响桤叶唐棣果酒酒精度的主次因素为发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞接种量（A），其中发酵温度（P＜0.000 1）和发酵时间（P=0.004 2＜0.01）是极显著因素，说明它们对桤叶唐棣果酒的发酵影响较大，而接种量（P=0.014 5＜0.05）是显著因素，说明酵母接种量对唐棣果酒发酵也有影响，但程度不如前两者。3个因素交互作用的响应曲面见图5所示。

由图5可知，试验点范围内酒精度产生了最大值，说明各因素所选水平合理，能反映出彼此间交互作用对唐棣果酒发酵的影响趋势。其中发酵时间与酵母接种量交互作用（P=0.001 4＜0.01）对唐棣果酒发酵影响极显著，交互作用的三维曲面比较陡峭，相应等高线呈椭圆形；而发酵温度与酵母接种量（P=0.014 8＜0.05）、发酵温度与发酵时间（P=0.010 3＜0.05）的交互作用响应曲面等高线略趋变圆，曲面较平滑，说明它们对酒精度的影响要低于前者。

通过响应面试验优化，得出桤叶唐棣果酒的最佳发酵工艺条件为酵母接种量0.06%，发酵温度25.05℃，发酵时间11.58 d，对应酒精度理论值为14%vol，为方便操作将条件修正为酵母接种量0.06%，发酵温度25℃，发酵时间12 d，按此条件进行3次平行验证试验，测定唐棣果酒的酒精度平均值为14.7%vol，与预测值基本吻合。所得桤叶唐棣果酒澄清透明，呈宝石红色，口感香醇，酒香清晰，具有桤叶唐棣风味，典型性突出，测定其钙含量为29.71 mg/100 mL，菌落总数≤10CFU/mL，大肠菌群数≤2MPN/100mL，致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）未检出，符合国标GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》中相关要求[22]。

图5 接种量、发酵温度、发酵时间交互作用对酒精度影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on alcohol content

3 结论

本研究通过对桤叶唐棣果酒发酵工艺条件进行分析，确定了发酵温度和发酵时间是影响果酒品质的两个关键性因素，采用响应面试验得到了桤叶唐棣果酒的最佳发酵工艺条件为初始糖度22%，酵母接种量0.06%，发酵温度25℃，发酵时间12 d。在此优化条件下，所得果酒呈明亮的宝石红色，口感香醇，具有清晰的桤叶唐棣风味，典型性突出。成品酒中钙含量为29.71mg/100mL，菌落总数≤10CFU/mL，大肠菌群数≤2 MPN/100 mL，致病菌未检出，符合国标GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》中相关要求[22]。本研究不但研发出了一种营养、风味俱佳的新型果酒，丰富了果酒市场产品类别，而且有助于进一步了解桤叶唐棣的品质及引种价值，拓展了开发思路，避免了资源的浪费和应用产品的单一化，具有一定的研究价值及意义。

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