果酒中有机酸的作用及检测方法研究

曾竟蓝，马胤鹏，秦 丹，2，曾 璐*，陈长松

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128；4.天下果业开发有限公司，湖南 湘西自治州 416000）

果酒是以水果为原料经发酵而制成，一般酒精度约为12%vol，属于低酒精度饮料酒[1]。果酒保留了水果的天然风味，富含多种维生素和氨基酸，适量饮用对衰老引起的脑机能退化、心血管疾病以及某些癌症的抑制有益[2-3]。近年来，人们开始提倡低度酒代替高度酒，饮用果酒成为一种趋势[4]。常见的果酒除葡萄酒外，还包括苹果酒、柑橘酒、荔枝酒、青梅酒、猕猴桃酒等。

果酒中所含的有机酸对于果酒的观感、口感和品质具有重要的影响，有机酸能溶解酒中的色素，使得果酒的颜色纯净美观[5]。而且有机酸含量的高低对果酒的口感有直接影响，酒中有机酸含量过低，会使酒体平淡乏味；而有机酸含量过高，则会导致酒体生硬粗涩[6]。

1 果酒中主要有机酸

果酒中的有机酸大多来自于酿制所用的新鲜果实，因此果品原料的有机酸组成和含量的差异是导致果酒有机酸种类、含量差异的主要原因，同时也带来了风味、口感等方面的不同。各种类果酒的酿造过程中有多种有机酸参与反应，如表1所示。其中有机酸对果酒品质的作用可分为对果酒风味构成有利的有机酸（如酒石酸、柠檬酸、苹果酸乳酸、琥珀酸等）以及对果酒品质不利、在生产中应尽量避免的有机酸（如乙酸、富马酸）。

表1 不同果酒中主要有机酸的种类和含量Table 1 Types and contents of the main organic acids in different fruit wine

续表

1.1 对果酒风味形成有利的有机酸

酒石酸存在于多种水果中，尤其在葡萄中大量存在，是葡萄酒最重要的特征有机酸。酒石酸稍有涩感、酸味强烈，在葡萄酒中的含量为1.0～3.0 g/L左右，酒石酸会在葡萄酒遇冷或酒精发酵过程中沉淀出来，使酒体酸度降低，陈酒中酒石酸质量浓度一般为2.5～4.0 g/L，在葡萄酒老熟之后，酒石酸一般减至1.5～2.5 g/L[20]。酒石酸不但是葡萄酒pH值高低的决定因素[7-8]，而且对酒体的口感、稳定性影响显著。如当葡萄酒中的酒石酸含量过高时，酒的口感粗硬并伴有涩感，品质不佳[21]。当酒石酸遭受乳酸细菌的侵蚀时，会分解形成乳酸，增加葡萄酒中的挥发酸含量，引起葡萄酒的“泛浑病”[22]。

柠檬酸具有清爽的酸味，口感温和爽快，有新鲜感，后味延续时间短[23]。其广泛分布于各种水果中，但因其品种及酿造工艺的不同，在果酒中含量差别很大，不同葡萄品种所酿造的葡萄酒中柠檬酸含量相差可达10倍[24]。除了来源于鲜果外，发酵过程中也会产生柠檬酸，它可作为底物在苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）中被消耗，并转变为挥发酸[25]。

苹果酸的酸度较大，其酸度比柠檬酸高20%，味道柔和，有特殊香味，稍带苦涩味，呈味时间较长[19]。水果中的苹果酸以L-型为主，在果酒酿造的苹果酸-乳酸发酵阶段，乳酸菌会消耗L-苹果酸并将其分解为L-乳酸和CO2，使酒体的酸涩度、粗糙度、色度等降低[26]。

果酒中的乳酸主要来源于酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵，其酸性很强，但酸味较温和，稍有涩感[13]。与苹果酸相比，乳酸的稳定性高且酸度低，因此经过苹果酸-乳酸发酵使苹果酸转化为乳酸，酸度减低，酒体更加稳定，不易变质[27]。

琥珀酸主要由酵母菌发酵过程中三羧酸循环的代谢、苹果酸-乳酸发酵过程中苹果酸的转化以及谷氨酸的转化而产生，是果酒发酵过程中的正常产物[28]。琥珀酸存在于各类果酒中，其口味复杂，既具酸味又有苦味，影响酒体风味的形成，是葡萄酒中最富于味觉反应的一种酸[29]。

1.2 果酒中不良有机酸

乙酸是酵母菌发酵的常规代谢产物，主要在发酵初期产生，具有很强烈的酸味，是酒类中的主要挥发酸[30]。在发酵后期或陈酿过程中，如果未能很好的隔绝氧气或被其他细菌污染，乙醇就会转变为乙酸。高含量的乙酸会掩盖果酒的香气，使果酒风味协调性降低，变得不柔和，并引起果酒的口硬和后苦[31]。研究发现葡萄酒中乙酸的最适质量浓度为0.2～0.7 g/L[32]。且我国国标规定葡萄酒中乙酸的最大含量不得超过1.2 g/L[33]。因此，乙酸是果酒是否被氧化以及被其他微生物污染的重要检验指标。

富马酸是柠檬酸三羧酸循环中的中间代谢产物之一，在果酒中的含量极低，对果酒的酸味影响很小。果实在正常代谢时无富马酸形成，但受到机械损伤或有虫害后，遭受外界环境中根霉菌的侵害造成污染，会导致富马酸的生成；工厂生产线中的不规范操作如生产线清洗不彻底会引起微生物发酵产生富马酸[34]。因此，富马酸含量的高低可以从侧面反映生产加工过程是否出现失误。

2 有机酸对果酒的作用

2.1 有机酸对果酒风味的影响

果酒中的酸是重要的呈味物质，与其他呈味物质共同组成果酒特有的芳香。酸含量过少的果酒，酒味寡淡、单调，酒体不协调；酸含量过高，则影响果酒整体的口感和风味，导致果酒酸味明显、刺舌[35]。因此，有机酸在调节果酒风味中作用显著，能起到除苦、减涩、缓冲口味、稳定香气的作用[36]。果酒中的有机酸分为挥发酸和不挥发酸。甲酸、乙酸等挥发酸分子质量小，刺激性强；乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸等不挥发酸能增加酒体的醇厚感；而其他一些有机酸（如葡萄糖酸、抗坏血酸、糖醛酸等）则对果酒风味的影响甚小[37]。另外，果酒中的有机酸在发酵和陈酿的过程中会与醇类物质作用产生香气物质（如乳酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸异戊酯等），赋予果酒清凉爽口的风味[12]。

2.2 有机酸对果酒pH的影响

果酒的酸度主要由有机酸的种类、浓度决定，酒体中游离H+的浓度越高，其pH值越低，酸度越高。影响果酒酸度的有机酸是羧酸类，其特征是含有羧基（-COOH），能解离成质子和共扼基团而显酸性，因此有机酸的种类和含量会对果酒的pH值产生一定程度的影响[38]。成冰等[39]对不同品种葡萄酒中的有机酸进行分析，发现与红葡萄酒相比，白葡萄酒中的总酸含量较低。卢倩文等[40]利用高效液相色谱法检测以西藏区天然野樱桃酒中的有机酸种类和含量，得出草酸和L-苹果酸是果酒中的主要有机酸，其次乙酸和酒石酸，乳酸和柠檬酸含量最少。因此，检测果酒有机酸含量，控制果酒酿制过程中酸度的变化，调整果酒pH值，对果酒的风味口感有至关重要的影响。

2.3 有机酸对果酒稳定性的影响

在果酒酿造过程中有机酸可加速多糖的转化和果胶物质的分解，促进果酒的老熟和澄清[41]。因此，适量的有机酸能平衡酒中的苦味，使酒醇厚爽口。果酒在经苹果酸-乳酸发酵后，有机酸转化，酸度降低，酒中的果香、醇香增加，生物稳定性提高[42]。果酒中的酒石酸能与钾、钙离子生成不溶性的酒石酸盐，从而沉于桶底或瓶底，在酒体的非生物性稳定性方面起到重要作用[43]。酒中酚酸类含量过高会破坏果酒非生物稳定性并赋予果酒较重的苦涩味[44]。柠檬酸能与铁离子形成可溶性络合物，在酒中加入少量柠檬酸（0.12～0.29 g/L）可有效防止铁破败病的产生[45]。

3 果酒中有机酸的检测方法

3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，用该方法检测果酒中的有机酸占利用色谱技术检测有机酸的70%以上，其准确率、重复性、便捷性均优于其他检测方法。果酒中有机酸的主要色谱条件为[46-49]检测器：紫外检测器；色谱柱：C18色谱柱或性能相当的色谱柱；检测波长：210～220 nm，柱温：25～30℃；流动相：甲醇或乙腈（5%～3%）-磷酸盐缓冲液（95%～97%），其中磷酸盐浓度0.01～0.05 mol/L，pH 2.5～3.0；流动相流速0.5～1.0mL/min；进样量10μL。在这些基本条件下各种酸的分离度、相关系数、回收率都较高。

ZOTOU A等[50]利用高效液相色谱法，采用ODS-2（250 mm×4 mm，5 μm）色谱柱，选择0.02 mol/L K2HPO4（pH 2.88）和体积分数2%的甲醇为流动相，以230 nm为紫外检测波长，在12 min内测定了葡萄酒中半乳糖醛酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的含量，回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均在规定范围内。梁红云等[51]建立了检测黑莓果酒中主要的6种有机酸（酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸）的高效液相色谱方法，其回收率为98.56%，RSD为0.21%。向进乐等[52]采用离子抑制反相高效液相色谱法测定菠萝原浆果酒中的有机酸。通过定性和定量分析，从菠萝原浆果酒中共检10种有机酸。其建立的检测方法精密度、重复性、样品测定日内稳定性良好，RSD为0.33%～1.99%，各有机酸的加标回收率为87.87%～106.96%。TASEV K等[53]利用高效液相色谱法对马其顿的白葡萄酒和红葡萄酒中的酒石酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸和丁二酸的含量进行分析测定。其检测方法的RSD为1.03%～3.99%，回收率95.0%～105.0%，各种酸的线性相关系数R＞0.999 3，具有较高的准确度和精密度。

由此可见，在测定果酒中的有机酸种类和含量方面，HPLC法具有操作快速、简便，结果可靠的优点，可作为检测有机酸的首推方法。

3.2 气相色谱法

气相色谱（gas chromatography，GC）使用成本较低，在果酒有机酸检测上已得到广泛应用。由于果酒的有机酸种类繁多，有些组分含量极低，一般条件处理较难检测，并且有些组分在分离提取时容易被破坏。对于这些含量较低和基质较复杂的样品，已有以下几种柱前处理方法：固相微萃取、树脂富集界面衍生、酯化筛选衍生。

杜曦等[54]应用衍生化气相色谱法测葡萄、葡萄酒中多元有机酸，通过碘乙烷与多元有机酸的四甲基铵盐反应，制备相应的乙酯，在SE-30色谱柱上进行分析测定。该方法的回收率均＞95%，RSD＜5.0%。高芸等[55]采用气相色谱定量分析了猕猴桃的有机酸含量。采用10%的硫酸甲醇对样品进行衍生化，用二氯甲烷萃取，最后进行气相色谱分析。结果表明，该方法的回收率较高（93.8%～102.3%），相关性较好（0.999 1～0.999 8），重复性好（RSD＜5%），且操作简单。邓丛蕊[56]利用界面衍生化气相色谱法来测定葡萄酒中总有机酸，用离子交换树脂分离、富集葡萄酒中总有机酸并直接在树脂界面上进行乙酯化，然后结合气相色谱-质谱法联用，鉴定并分析了葡萄酒中21种有机酸，该方法的精密度、重现性有较好，回收率为92.2%～104.3%。

由于有机酸的沸点较高、不易气化，在使用气相色谱法测果酒有机酸时，需要先对其衍生再进行测定，其操作方法较为繁琐，不利于实践应用。

3.3 离子色谱法

离子色谱法（ion chromatography，IC）具有灵敏度高、重复性好、操作简单及分析时间短等优点，是检测果酒中有机酸的常用方法。按分离原理可分为离子交换色谱法（ionexchangechromatography，IEC）和离子排斥色谱法（ion exclusion chromatography，ICE）两种。

周建科等[57]利用离子排斥色谱法，以Shim-Pack SCR-102H色谱柱（8 mm×300 mm，7 μm）为分离柱，2.0 mmol/L盐酸溶液作为淋洗液，分离并测定了苹果醋中6种有机酸（草酸、柠檬酸、DL-苹果酸、琥珀酸、戊二酸、乙酸）的含量。有机酸的检测限在9.17～78.0 mg/L，各组分回收率为90%～110%，具有较好的准确度和精密度。宋卫得等[58]建立了梯度淋洗离子色谱法测定白酒中18种有机酸的方法。采用AS11-HC阴离子分离柱（4 mm×250 mm），KOH溶液多级梯度淋洗，电导检测器检测，在流速为1.00 mL/min，柱温为30℃时，18种有机酸在0.02～2.00 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系（R值均＞0.99），回收率为73.50%～115.13%，精密度实验结果相对标准偏差（RSD）为3.38%～4.97%。成霈等[59]采用戴安ICS1500离子色谱仪配合淋洗液梯度洗脱的方法在抑制电导模式下同时测定果酒中的酒石酸、苹果酸、柠檬酸、抗坏血酸、乳酸。该方法在葡萄酒、猕猴桃酒、石榴酒等果酒产品中有机酸的测定中，RSD均＜1%，加标回收率均在91%～98%。何攀[60]使用Ion Pac AS11-HC分离柱，以15%的甲醇和氢氧化钠为流动相，梯度洗脱葡萄酒中有机酸（乳酸、乙酸、丁二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸）的含量，建立了用离子色谱法同时分离葡萄酒中6种主要有机酸的色谱条件。潘丙珍等[61]采用Ion Pac AS11阴离子交换分离柱，以氢氧化钾为淋洗液，流速1.0 mL/min进行梯度洗脱，通过抑制电导检测器进行检测。建立了离子色谱-电导检测法测定葡萄酒中有机酸的分析方法。该方法对11种有机酸具有良好的线性，相关系数在0.9909～0.9997；准确度和精密度良好，样品加标回收率在81.0%～117.8%，RSD＜5.0%。

离子色谱法虽然不需要样品进行预处理或柱后处理，但由于淋洗液和柱填料的特殊性，对样品中蛋白质含量有严格限定，不适用于分析成分复杂的样品，并且其分析样品的周期较长。

3.4 其他方法

果酒中有机酸的测定方法不仅仅只有上述几种，还有毛细管电泳法、酸碱滴定法、比色分析法、薄层色谱法等。

毛细管电泳法是以是石英毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的差异而实现分离的电泳分离分析方法，具有高效快速，简单、便宜的优点[62-63]。唐美华等[64]运用毛细管区带电泳法直接测定了葡萄酒中8种有机酸。各有机酸线性相关系数在0.999 0～0.9998，加标回收率为91.9%～116.9%，RSD为3.68%～5.41%。方法简便、快速、准确，可对葡萄酒酿造过程快速监控，并对酒的品质进行监测。李永库等[65]应用毛细管电泳-质谱联用法同时测定葡萄酒中草酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、酒石酸和乳酸8种主要有效成分的含量。在未涂层石英毛细管（50 μm×80 cm）中，以40.0 mmol/L醋酸铵（用1.0 mol/L醋酸调至pH 4.5）为缓冲溶液，30%异丙醇（含3.0 mmol/L氨水）为鞘液，分离电压25.0 kV，各组分在15min内得到完全分离。种组分的加标回收率为87.6%～98.2%，RSD为2.7%～5.6%。尽管毛细管电泳法操作简单、检测结果准确，但与以上3种方法相比，其灵敏度和重现性方面仍存在不足，还有待进一步的提高和改善。

酸碱滴定法、比色分析法和薄层色谱法虽然操作简便，但其灵敏度低，杂质干扰严重，与上述几种检测方法相比具有一定的局限性，因此不是分析检测果酒有机酸的首选方法。

4 总结与展望

果酒中的有机酸虽不直接参与构成果酒的香气，但其特有的酸味和口感，是果酒中主要的呈味物质，是果酒一项重要的品质特征。本文对果酒的有机酸及其在果酒中的重要作用进行了归纳和总结，目前关于有机酸在果酒中的呈味、呈香机理的研究报道较少。同时，在果酒酿造过程中有机酸的变化规律、各有机酸最适含量的控制以及建立果酒酸类物质与风味相结合的综合评价体系等方面还需进行深入的试验与探究。

目前果酒中有机酸的检测方法主要是色谱法，包括高效液相色谱法、气相色谱法以及离子色谱法等。在这些方法中，使用最广泛的是高效液相色谱法。与其他几种检测方法相比，高效液相色谱法具有前处理简单，检测周期短的优点，一次性能检测果酒中6～10种有机酸。但其在检测酒中一些痕量的有机酸组分方面，还存在检测结果误差较大的缺点，因此在扩大检测范围、提高检测灵敏度和准确度方面有待进一步改进和提高。

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