复合酶澄清剂在啤酒酿造中的应用研究

2018-07-09陈嘉盛

中国酿造 2018年6期

付博，段杉，齐明，陈嘉盛

（1.佛山职业技术学院食品系，广东佛山 528137；2.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

啤酒稳定性研究是啤酒行业多年来的重要课题[1-3]。啤酒生产中添加合适的酶，可以稳定或提高啤酒的质量[4-6]，这使得越来越多的企业在啤酒生产过程中添加各种酶制剂，但使用单一的酶来提高啤酒澄清度会因酶的专一性带来一定的局限性[7-9]，如单一的酶澄清剂受酶高度专一特性的限制，难以解决啤酒因不同原因产生的浑浊、沉淀问题[10]。而将单一酶制成复合酶制剂则可弥补各种酶的缺点，得到较好的效果[11-14]。因此，啤酒复合酶澄清剂将是啤酒澄清剂研发的重要方向，具有很高的研究价值。

本试验通过单因素试验选定果胶酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶作为啤酒复合酶澄清剂，并在小试试验中研究了其用量对啤酒澄清度及pH、浊度、持泡性、色度的影响，从中选取对啤酒澄清度及其他质量指标提高最明显的添加量，并在此基础上利用Box-Behnken试验设计对发酵过程中果胶酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶的用量进行优化，并以小试试验确定的复合酶澄清剂进行中试试验，对啤酒质量进行检测，并对啤酒感官指标进行评定，以此验证其效果，旨在为配制啤酒复合酶澄清剂应用于生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 啤酒生产原料

麦芽（澳大利亚）、啤酒花（捷克苦花、捷克香花）、法国S-189下面酵母酵母：市售。

1.1.2 酶制剂

木瓜蛋白酶（酶活80万U/g）、菠萝蛋白酶（酶活50万U/g）、果胶酶（酶活20万U/g）、中性蛋白酶（酶活6万U/g）：郑州万博化工产品有限公司。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限；PHS-3C酸度计：上海仪电科学仪器有限公司；WGZ-2PJ浊度计：上海听瑞仪器仪表有限公司；DV314C电子分析天平：美国奥豪斯公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 啤酒发酵条件

前发酵时间为4～5 d，发酵温度为12℃；后发酵时间5～6 d，发酵温度12℃；发酵完成后以双层中速滤纸抽滤。

1.3.2 酶制剂的筛选

本试验根据酶制剂在啤酒澄清方面的研究报道[10]，以麦芽质量计，分别研究木瓜蛋白酶（640 U/100 g）、果胶酶（800 U/100 g）、中性蛋白酶（90 U/100 g）、菠萝蛋白酶（800 U/100 g）对啤酒的澄清效果；在麦汁糖化冷却后，在4种小试样中分别加入酶（以无菌冷水溶解酶粉后加入）后进行发酵，发酵完成后，对啤酒的浊度、色度、pH、持泡性、感官指标（包括色泽、香气、泡沫、口感）进行分析，确定其中3种澄清效果较好的酶制剂作为啤酒复合酶澄清剂，并通过单因素试验确定较好添加量。

1.3.3 Box-Behnken试验

在单因素试验的基础上，利用3因素3水平Box-Behnken试验设计连同响应面法优化3种酶的添加量以提高啤酒质量。Box-Behnken响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 检测方法

采用国标GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[15]测定啤酒的色度（分光光度计法）、浊度、持泡性（秒表法）、啤酒品质感官评价、总酸（指示剂法）、酒精度（密度瓶法）；pH的测定[16]：用pH 4.00和pH 6.86的缓冲溶液校准pH计后测定；α-氨基酸态氮测定[17]：茚三酮法。

2 结果与分析

2.1 酶制剂初步筛选结果

表2 添加各种酶对啤酒质量的影响Table 2 Effect of adding various enzymes on beer quality

由表2可知，在加入各种酶制剂后，除加入中性蛋白酶的试样浊度略微提高外，其他均有不同程度的降低，色度下降明显，持泡性总体上略有提高；添加酶后发酵液pH值变化不大；除木瓜蛋白酶与原啤酒总体风格不符外，其他3种酶对啤酒主要感官评价影响不大。因此，初步选择果胶酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶配制啤酒复合酶澄清剂，并进一步研究其用量对啤酒澄清度和其他质量指标的影响。

2.2 果胶酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶添加量对啤酒质量的影响

由表3可知，添加720U/100g、760U/100g、800U/100g、840 U/100 g、880 U/100 g的果胶酶后，啤酒浊度均有不同程度的降低；色度下降明显；持泡性总体上略有提高（添加760 U/100 g麦芽时略有降低）；发酵液pH值变化不大；果胶酶添加量为840 U/100 g时啤酒感官评分较高，因此选择果胶酶添加量为800 U/100 g、840 U/100 g、880 U/100 g麦芽进行后续试验。

表3 果胶酶添加量对啤酒质量的影响Table 3 Effect of pectinase addition on beer quality

由表4可知，添加78 U/100 g、84 U/100 g、90 U/100 g、96 U/100 g、102 U/100 g的中性蛋白酶后，啤酒浊度除添加78 U/100 g有明显下降外（下降幅度达到21.1%），其他添加量条件下均有所提高，但增幅均不明显；色度下降明显；持泡性有不同程度的提高；发酵液pH值变化不大；果胶酶添加量为78 U/100 g、84 U/100 g时，啤酒感官评分较高。综合考虑啤酒的浊度、色度及感官评分，选择中性蛋白酶添加量为78U/100g、84U/100g、90U/100g麦芽进行后续试验。

表4 中性蛋白酶添加量对啤酒质量的影响Table 4 Effect of neutral-protease addition on beer quality

由表5可知，添加600U/100 g、700 U/100 g、800 U/100 g、900 U/100 g、1 000 U/100 g麦芽的菠萝蛋白酶后，啤酒浊度除添加600 U/100 g麦芽时略有提高外，其他添加量均有不同程度的降低；色度下降明显；持泡性有不同程度的提高；发酵液pH值变化不大；啤酒感官评分与对照相比波动不大。考虑到啤酒的浊度和色度是评价啤酒澄清度的最重要指标，因此选择菠萝蛋白酶添加量为800 U/100 g、900 U/100 g、1 000 U/100 g麦芽进行后续试验。

表5 菠萝蛋白酶添加量对啤酒质量的影响Table 5 Effect of bromelain addition on beer quality

2.3 Box-Behnken试验优化酶添加量

在单因素试验的基础上，利用3因素3水平的Box-Behnken试验设计连同响应面法优化3种酶（X1果胶酶、X2中性蛋白酶、X3菠萝蛋白酶）的添加量以提高啤酒质量，即获得pH值（Y1）波动小、浊度（Y2）低、持泡性（Y3）好、色度（Y4）低的啤酒。

选择Box-Behnken进行3水平的试验设计，得到（15×3）的矩阵，一共15次试验；其中1～12号是析因试验，13～15号是中心试验。15个试验点分为析因点和零点，其中分析因点为自变量取值在X1、X2和X3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。具体的试验设计见表6。

在以上试验设计的基础上，采用Design-Expert 8.0对试验数据进行二次多项式的响应曲面分析（模型置信度取值为95%）；采用MATLAB 7.0作模型的平面预测线，得到啤酒质量的响应面参数。

表6 酶的添加量优化Box-Behnken试验设计与结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments forenzyme addition optimization

麦汁质量指标与各种酶添加量之间的回归方程如下：

2.4 外加酶对啤酒质量指标的影响

2.4.1 外加酶对啤酒发酵pH的影响

图1 果胶酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶添加量交互作用对啤酒发酵pH值影响的响应面和等高线Fig.1 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on pH value of beer

由图1可知，3种酶的添加量对pH值的影响不显著，即添加各种酶对发酵的pH没有太大的影响。考虑到在发酵过程pH相对稳定对生产比较有利，因此得出，果胶酶添加量为820～860 U/100 g时较好；中性蛋白酶添加量为84～88 U/100 g时较好；菠萝蛋白酶添加量为860～910 U/100 g时较好。说明酶制剂对响啤酒发酵的pH环境影响很小。

2.4.2 外加酶对啤酒发酵浊度的影响

图2 果胶酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶添加量交互作用对啤酒浊度影响的响应面和等高线Fig.2 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on turbidity of beer

由图2可知，3种酶的添加对啤酒的浊度影响很显著。浊度随菠萝蛋白酶添加量的提高而上升。同时，浊度也随着中性蛋白酶添加量的增加呈现出总体上升的趋势。而浊度随着果胶酶添加量的提高而上升，而后有一种下降趋势。总体而言，这3种酶对浊度的拟合较好，果胶酶添加量为800U/100g或880U/100g、中性蛋白酶添加量为78 U/100 g、菠萝蛋白酶添加量为800 U/100 g时均能找到最低浊度。

2.4.3 外加酶对啤酒发酵持泡性的影响

由图3可知，持泡性受中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的影响较明显，受果胶酶的影响较弱。只要保证中性蛋白酶、菠萝蛋白酶的添加量在合适的范围内，持泡性就能保持在125 s以上。考虑到持泡时间长啤酒质量较好，因此中性蛋白酶添加量为78 U/100 g、菠萝蛋白酶添加量为880～905 U/100 g时持泡性最好，而果胶酶对持泡性的影响则可忽略。

图3 果胶酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶添加量交互作用对啤酒发酵持泡性影响的响应面和等高线Fig.3 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on foam-holding of beer

2.4.4 外加酶对啤酒色度的影响

图4 果胶酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶交互作用对啤酒色度影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface plots and coutour line of effects of interaction between pectinase,neutral-protease and bromelain addition on chroma of beer

由图4可知，色度受酶添加量的影响十分显著。三种酶对色度的拟合很好，在测定范围内均能找到最低的色度。果胶酶添加量为880 U/100 g、中性蛋白酶添加量为78 U/100 g、菠萝蛋白酶添加量为840～880 U/100 g时啤酒色度达到最低。

2.5 响应面分析结果的试验验证

确定酶的最优添加量应能保证啤酒发酵时的稳定性，同时，为了保证啤酒产品的口感、风味不受影响，因此添加酶制剂时要遵守尽量不加或尽量少加的原则，并且要考虑使用成本与添加效率之间的平衡。因此，在综合考虑啤酒质量指标（特别是对啤酒澄清度有显著影响的指标：浊度）及添加酶制剂的原则后，进一步确定了最佳添加量，即果胶酶添加量为880 U/100 g、中性蛋白酶添加量为78 U/100 g、菠萝蛋白酶添加量为800 U/100 g。而在此条件下，啤酒指标理论值pH值为4.58，浊度为9.03 EBC，持泡性为144.3 s，色度为10.1 EBC。

为了验证数据模型的准确性，在以上最优添加量下进行了3次平行重复性发酵试验，结果见表7。由表7可知，添加酶制剂后啤酒的pH值为4.58（提高0.2%），浊度为7.7 EBC（降低14.4%），持泡性为144s（提高102.8%），色度为9.9EBC（降低2.9%），总酸为0.34 mL/100 mL（未变化），酒精度为4.4%vol（提高7.3%），α-氨基酸态氮为181mg/L（提高15.3%），感官评分为84.67分（提高0.67%）。

表7 复合酶澄清剂对啤酒质量的影响Table 7 Effect of compound enzyme clarifier on beer quality

3 结论

通过对酶筛选试验选取了果胶酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶作为啤酒复合酶澄清剂，并利用Box-Behnken试验设计对其的添加量进一步优化，通过响应面试验得出最优酶的添加量为果胶酶880 U/100 g，中性蛋白酶78 U/100 g，菠萝蛋白酶800 U/100 g。在此条件下，啤酒的浊度降低了14.4%，色度降低了2.9%，持泡性提高了102.8%，α-氨基酸态氮含量提高了15.3%。这种啤酒复合酶澄清剂的添加对啤酒的总酸、酒精度、pH值、感官评价没有太大的影响，更重要的是啤酒浊度、色度均有下降，起到了较为明显的澄清作用，具有很高的应用价值。

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