以魔芋多糖为碳源的产聚羟基丁酸酯菌的筛选、鉴定及发酵研究

李凌凌，毛 伟，张家铭，黄 皓，左振宇，杨忠华

(1.武汉科技大学化学与化工学院，湖北 武汉，430081；2. 武汉科技大学煤转化与新型炭材料湖北省重点实验室，湖北 武汉，430081)

魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)的主要成分是甘露糖和葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接起来的线性高分子化合物[1]，可作为底物诱导微生物生产β-1,4-D-甘露聚糖酶(即β-甘露聚糖酶)[2]，并在酶的作用下分解成能被人体吸收利用的魔芋低聚糖。魔芋低聚糖能有效改善肠道内菌群结构，还可用于治疗高血脂症、预防动脉硬化和冠心病的发生[3-4]。考虑到β-甘露聚糖酶为胞外水解酶，以魔芋多糖为碳源培养的微生物发酵液经离心处理获得含魔芋低聚糖的上清液后，会产生大量的菌体沉淀，如何利用这些菌体废弃物开发具有应用前景的产品是一个重要的研究课题。

聚羟基烷酸酯(PHAs)作为一类由微生物合成的细胞内聚酯，是胞内积累的碳源和能源储存物，其典型代表为聚羟基丁酸酯(PHBs)。PHB具有生物降解性、热塑性和生物相容性，并且无毒，被认为是石油化学聚合物的替代品[5-6]。但是，与石油化工材料相比，利用微生物发酵法生产PHB的成本很高，严重制约了其大规模生产和应用。研究表明，采用廉价碳源(如食品废弃物[7]、粗甘油[8-9]、半纤维素水解液[9]、废菜籽油[10]、皂化废棕榈油[11]等)培养微生物，可以使PHB的生产成本降低。目前已报道的能够积累PHB的微生物种类虽然不少，但仍然有许多潜在的聚羟基丁酸酯生产菌未被发现，另外，不同微生物积累PHB所需的碳源也不尽相同[7,9]，因此，很多学者一直致力于从各种环境中分离获得可以利用廉价碳源合成PHB的新型细菌，从而将微生物发酵法应用到PHB工业化生产中。

我国的花魔芋和白魔芋资源丰富[1]，可以为微生物发酵生产PHB提供大量廉价的魔芋多糖作为碳源。本研究拟筛选以魔芋多糖为碳源在细胞内合成聚羟基丁酸酯的菌株，达到降低PHB生产成本的目的，并且同时获得魔芋低聚糖和生物降解材料PHB两种高附加值产品。

1 试验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

富集培养基：魔芋精粉2.0 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.3 g，NaCl 0.5 g，加蒸馏水定容至100 mL，用于富集培养可产β-甘露聚糖酶的细菌。

固体分离培养基：魔芋精粉1.0g，NaNO30.3g，K2HPO40.1g，KCl 0.05g，MgSO40.05g，FeSO40.05 g，琼脂1.8 g，加蒸馏水定容至100 mL，用于分离纯化可产β-甘露聚糖酶的细菌。

LB培养基：按照文献[12]配制，用于观察细菌的菌落特征、液体培养特征、运动性及与氧气的关系。

修正的M9培养基：Na2HPO40.678 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.05 g，NH4Cl 1.8 g，CaCl20.001 g，MgSO4·7H2O 0.0492 g，葡萄糖0.786 g，加蒸馏水定容至100 mL，pH调至7.0，用于优化菌体的聚羟基丁酸酯生产条件。

1.1.2 酶和化学试剂

pMD18-T载体连接试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品；通用型柱式基因组DNA提取试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞和2×ES Taq MasterMix(含染料)为康为世纪生物科技有限公司产品；PCR产物纯化回收试剂盒(Cycle-pure kit)为美国OMEGA公司产品；引物合成和测序工作由武汉擎科创新生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 以魔芋多糖为碳源合成PHB的菌株筛选

(1)菌株的富集及分离纯化

取云南种植魔芋的农田土壤样品1 g加到100 mL富集培养基中，在30 ℃、150 r/min的恒温摇床中培养24 h。取1 mL富集培养的菌液稀释涂布到固体分离培养基上，30 ℃培养24 h。挑取菌落在固体分离培养基上划线，待菌苔生成后镜检，如果菌体不纯，则继续划线纯化培养，直至镜检下出现单一形态的菌体。

(2)菌株的筛选

挑取纯化后的单菌落点接到固体分离培养基上，待菌落生成后，用刚果红溶液染色0.5 h，再用生理盐水洗去刚果红染液，观察菌落周围有无透明圈，作为菌株产β-甘露聚糖酶能力的初步检测标准[13]。选择透明圈大的菌株，检测其合成PHB的能力：细菌经苏丹黑染色后在光学显微镜下观察，若视野中60%的细菌内有蓝黑色颗粒，则为产PHB的菌株[14]，命名为LKH。

1.2.2 以魔芋多糖为碳源合成PHB的菌株鉴定

(1)菌株个体形态观察和生理生化特征鉴定

革兰氏染色及芽孢染色、细菌的生理生化特征鉴定均参照文献[12]。

(2)菌株最适生长温度和pH值的确定

为了研究温度对菌株生长的影响，以10%的接种量接种处于对数期的菌株LKH到一组修正的M9液体培养基中，分别置于25、28、30、37、40 ℃的恒温摇床(200 r/min)中振荡培养24 h，检测培养液的OD600值。另外，以10%的接种量接种处于对数期的菌株到一组pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的修正的M9液体培养基中，置于30 ℃恒温摇床(200 r/min)中振荡培养24 h，检测培养液的OD600值，以研究培养基的pH值对菌株生长的影响。

(3)系统发育树的构建

按照通用型柱式基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株LKH的基因组DNA。使用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系：菌体LKH的基因组DNA 1 μL，2×ES Taq MasterMix(含染料)12.5 μL，引物27F(20 μmol/L)1 μL，引物1492R(20 μmol/L)1 μL，无菌水补至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，之后按如下程序(95 ℃变性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s)进行35个循环，最后一个循环72 ℃延伸10 min。根据pMD18-T载体连接试剂盒说明书，将菌株LKH的16S rDNA的PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上，构建重组载体pMD-LKH。重组质粒的测序结果提交到NCBI数据库进行Blast比对，利用EBI数据库中的Clustal Omega功能进行多重序列比对，使用软件MEGA 5.0构建系统发育树，其中根据maximum composite likelihood model计算进化距离，采用neighbor-joining statistical method构建进化树。

1.2.3 生长曲线的绘制

取1 mL处于对数期的菌株接种到100 mL修正的M9液体培养基中，在30 ℃、200 r/min的恒温摇床中振荡培养。每隔一定时间取样，测定菌液的OD600值。试验设置3个平行组，取平均值绘制菌液的OD600随时间的变化曲线(即生长曲线)。

1.2.4 PHB发酵条件的优化

(1)PHB的提取及分析方法

采用氯仿-次氯酸盐法提取PHB[15]，参照文献[16]计算PHB的含量和提取率。将PHB标准样品和从菌株LKH中提取并纯化的白色薄膜样品经甲酯化后进行气相色谱分析[16]，同时两类样品用KBr压片后进行红外光谱检测[17]。

(2)碳源的优化

取1 mL处于对数期的菌株接种到100 mL添加相同质量碳源(分别为花生油、亚油酸、亚麻酸、油酸、纤维素、魔芋精粉、葡萄糖)的修正的M9液体培养基中，在30 ℃、200 r/min的恒温摇床中振荡培养4天，提取PHB，测定其含量(即PHB的纯度)，计算PHB提取率。

(3)氮源浓度的优化

以魔芋精粉为碳源物质，配制分别含有0.1、0.2、1、5、10、20 g/L氮源NH4Cl的修正的M9液体培养基。取1 mL处于对数期的菌株接种到100 mL上述培养基中，在30 ℃、200 r/min的恒温摇床中振荡培养4天，提取PHB，测定其含量，计算PHB提取率。

2 结果与分析

2.1 产聚羟基丁酸酯菌LKH的筛选

挑取固体分离培养基上刚果红染色水解圈较大的菌株(见图1(a))进行苏丹黑染色(见图1(b))，结果呈阳性，且胞内的蓝黑色颗粒较多，初步推断该菌能够分泌β-甘露聚糖酶，水解魔芋精粉以提供生长所需的碳源，同时在胞内合成PHB。

(a)刚果红染色的水解圈

(b)苏丹黑染色

2.2 产聚羟基丁酸酯菌LKH的鉴定

2.2.1 菌株LKH的个体形态特征

在光学显微镜下，菌株LKH呈杆状，可游动、旋转，革兰氏染色为紫色，呈阳性，芽孢染色为绿色，呈阳性，芽孢形态为椭圆形。

2.2.2 菌株LKH的群体形态特征

菌株LKH在LB固体培养基上生长24 h后长出的菌落为乳白色，圆形，不透明，表面光滑湿润，黏度较大，边缘整齐且中间隆起(见图2a)。菌株LKH在LB半固体培养基的穿刺试验结果如图2(b)所示，菌体在穿刺部位的四周呈云雾状生长，推断菌株LKH兼性好氧，可运动。

(a)菌落特征 (b)穿刺试验结果

图2菌株LKH的形态特征

Fig.2MorphologicalcharacteristicsofStrainLKH

2.2.3 菌株LKH的最适生长温度和pH值

温度和培养基pH值对菌株LKH生长的影响如图3所示。由图可见，在25～40 ℃的温度范围内，菌株LKH在修正的M9液体培养基中都可以较好地生长，其中在28 ℃下生长得最好。另外，当培养基pH值低至4.0时，菌株LKH不能正常生长，而在pH 值为6.0～8.0的范围内，菌株在修正的M9液体培养基中都可以很好地生长，其中菌株LKH的最适生长pH值约为7.0，此时生物量最大。

(a)温度

(b)培养基pH值

Fig.3EffectsoftemperatureandpHofculturemediumonthegrowthofStrainLKH

2.2.4 菌株LKH的生理生化特征

菌株LKH的生理生化特征如表1所示，为了便于后续的对比分析，表1中同时列出了菌株NRRL NRS-1356[18]和菌株M17[19]的生理生化特征。由表1可见，菌株LKH的接触酶反应为阳性，氧化酶反应为阴性，可以向胞外分泌淀粉酶、脂肪酶和脲酶，能够液化明胶。菌株LKH的IMViC试验结果分别为：Voges-Proskauer(V-P)反应为阳性，即细菌可以发酵葡萄糖生成乙酰甲基甲醇；柠檬酸试验呈阳性反应，即可以利用柠檬酸盐产生碱性碳酸盐，使培养基pH值升高从而变成蓝色；但菌株LKH的甲基红反应呈阴性，且不可产生色氨酸酶分解色氨酸产生吲哚。菌株LKH不能水解培养基中的含硫氨基酸生成H2S，也不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。在糖发酵试验中，菌株LKH可利用木糖、葡萄糖、半乳糖和麦芽糖产酸和少量的气，而利用乳糖时不能产酸和气。另外，菌株LKH可以在分别以葡萄糖、乳糖、魔芋精粉、纤维素、油酸、亚油酸、亚麻酸及花生油为唯一碳源的M9培养基上生长，但不能以正辛酸或正癸酸作为唯一碳源生长。菌株LKH可以在40 ℃生长，但不能在4 ℃生长，其最适生长温度为28 ℃，最适生长pH值为7.0。

表1 菌株LKH的生理生化特征

注：+代表阳性结果；-代表阴性结果；N代表未知。

2.2.5 系统发育树

对菌株LKH的16S rDNA的PCR扩增产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4(a)所示，可见PCR扩增产物在1500 bp左右有清晰条带。将PCR扩增产物切胶回收后，连接到pMD18-T质粒上，构建重组载体pMD-LKH，其PCR鉴定结果见图4(b)。将重组载体送交测序，获得一段长1449 bp的核苷酸序列，利用NCBI数据库提供的BlastN功能进行核苷酸比对，结果显示菌株LKH与类芽孢杆菌属的依利诺斯类芽孢杆菌(Paenibacillusillinoisensis)的亲缘关系最接近，其中与P.illinoisensisF24菌(登录号JQ579623.1)、NBRC 15959(登录号NR_113828.1)、JCM 9907(登录号NR_040884.1)的序列一致性高达99%。根据16S rDNA序列的相似性，利用Clustal Omega和Mega 5.0软件构建系统发育树，如图5所示，图中括号内为基因序列的登录号。由图可见，菌株LKH与P.illinoisensis的进化关系最近。

(a)16S rDNA基因的PCR扩增产物 (b)质粒pMD-LKH的PCR鉴定产物

图4PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

Fig.4ElectrophoretogramofPCRproducts

图5 根据16S rDNA序列的同源性构建的系统发育树

综上所述，菌株LKH归属于依利诺斯类芽孢杆菌P.illinoisensis。P.illinoisensis是1997年由Shida等从Bacilluscirculans的第6组中抽出来归到类芽孢杆菌属[18]。P.illinoisensis的细胞是杆状，大小为(0.5～0.8)μm×(3.0～5.0)μm，革兰氏染色阳性，周生鞭毛，可运动，产椭圆形芽孢。从个体和菌落的形态及生理生化特征(见表1)上看，菌株LKH与依利诺斯类芽孢杆菌及M17菌都很接近，但是这3种菌株的某些生理生化特征存在着一定的差异，譬如：菌株LKH的最适生长温度为28 ℃，V-P反应为阳性，能够利用柠檬酸盐，脲酶反应为阳性，吲哚反应和硝酸盐还原试验均为阴性，而菌株NRRL NRS-1356的最适生长温度为37 ℃，V-P反应为阴性，不能利用柠檬酸盐，菌株M17的脲酶反应和V-P反应为阴性，硝酸盐还原试验和吲哚反应均为阳性。生理生化特征的差异反映了这些菌株的生存环境和自身遗传背景的不同。

目前发现的可以在胞内积累PHAs的微生物种类很多，主要有产碱杆菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红螺菌属(Rhodospiriclum)、甲基营养菌属(Methylotrophs)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、贪铜菌属(Cupriavidus)、链霉菌属(Streptomyces)、极端嗜盐杆菌(Haloferax)等[5,17,20-21]。类芽孢杆菌属是一类广泛存在于自然界的好氧/兼性厌氧、可产生芽孢的杆状细菌，在生物医药、生物修复等领域都有重要的应用[22]。虽然迄今为止鲜有类芽孢杆菌属胞内积累PHBs的报道，但是，考虑到多数类芽孢杆菌属的菌种是从芽孢杆菌属抽出重新分类的，相信今后有关类芽孢杆菌属中提取出PHBs的报道会层出不穷。

2.3 菌株LKH的生长曲线

根据不同时间取样的菌株LKH悬浮液的OD600绘制生长曲线，如图6所示。菌株LKH在0～4 h内处于生长延滞期，生长较为缓慢；4～24 h之间菌体进入对数生长期；24 h后，菌株开始达到生长稳定期，此时生物量达到最大值；培养至96 h后，菌株开始进入衰亡期。由于PHB是微生物在非平衡的营养条件下进行胞内合成的，故定于第4天提取PHB。

图6 菌株LKH的生长曲线

2.4 菌株LKH的PHB发酵条件优化

2.4.1 碳源种类对PHB合成的影响

不同碳源培养的菌株LKH中提取的PHB含量及提取率如表2所示。从表2中可以看出，菌株LKH在以葡萄糖为唯一碳源的条件下提取获得PHB的质量最多，含量(即纯度)也最高(达到43.89%)；菌株LKH以油酸为唯一碳源生长时的PHB提取率最高(49.70%)；菌株LKH以魔芋精粉为唯一碳源合成PHB的质量可达0.52 g/L，含量达到40.62%，PHB提取率可以达到40.25%。

表2 不同碳源培养的菌株LKH中提取的PHB含量及提取率

图7 以魔芋精粉和葡萄糖为唯一碳源培养的菌株LKH中所提取PHB的红外光谱

不同碳源培养的菌株LKH中提取出来的白色薄膜样品经甲酯化后进行气相色谱分析，其结果显示均与PHB标准品一致。图8为PHB标准品、分别以魔芋精粉和葡萄糖为唯一碳源培养的菌体中合成的白色薄膜样品的气相色谱。由图可见，提取的样品在1.49 min附近出现氯仿峰，在1.67min附近出现甲酯化的PHB单体组分峰，在5.42min附近出现内标物苯甲酸的峰，表明提取物中含有一定量的PHB。但是，气相色谱图中还有很多杂峰，表明提取的PHB纯度不高，这与前面所测的PHB含量约为40%的结果符合。

(a)PHB标准品

(b)以魔芋精粉为碳源发酵提取的PHB

(c)以葡萄糖为碳源发酵提取的PHB

2.4.2 氮源浓度对PHB合成的影响

聚羟基烷酸酯是一类微生物在不平衡的生长条件下胞内合成的碳源和能源贮藏物，所谓不平衡生长条件为碳源相对过量，氮源等营养物质相对缺乏。因此，本试验在固定碳源为魔芋精粉的基础上，考察了不同氮源(NH4Cl)浓度对PHB合成的影响，结果如表3所示。从表3中可知，氮源浓度越低，即C/N比越大，PHB的提取率就越高；在氮源浓度为0.2 g/L时，PHB的质量达到最高(0.85 g/L)，含量高达69.55%，提取率达到93.29%。

表3 不同氮源浓度下培养的菌株LKH中提取的PHB含量及提取率

3 结论

(1)从云南种植魔芋的土壤中分离得到了一株能以魔芋多糖为唯一碳源生长的菌株LKH，该菌能够分泌β-甘露聚糖酶水解魔芋多糖生长，经苏丹黑染色鉴定，菌株可以在胞内积累PHB。

(2)经形态学、生理生化鉴定和16s rDNA序列同源性分析，菌株LKH归属为依利诺斯类芽孢杆菌Paenibacillusillinoisensis。

(4)在氮源浓度为0.2 g/L的条件下，菌体LKH以魔芋多糖为唯一碳源合成的PHB质量高达0.85 g/L，含量高达69.55%，PHB提取率为93.29%。P.illinoisensisLKH在发酵魔芋多糖生产魔芋低聚糖的同时可胞内合成PHB，实现了菌体废弃物的二次开发利用，有望降低微生物发酵生产PHB的成本。

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