急性HIV感染者γδ T细胞及其细胞亚群的表型分析①

吴 江 王 蕊 画 伟 王桂芳 李群辉 李 珍

(中国疾病预防控制中心科技开发办公室，北京 100050)

γδ T细胞是一种天然免疫细胞，主要分为Vδ1和Vδ2 T细胞两种亚群，在抗HIV感染中发挥重要作用[1]。HIV感染导致机体免疫细胞高度活化，T、B淋巴细胞等免疫细胞表面活化、增殖、凋亡分子的表达增加[2]。慢性免疫活化可以引起免疫耗竭，抑制性分子的表达增加[3,4]。HIV通过调节PD-1等抑制性分子的表达而形成免疫逃逸，使HIV持续存在[5,6]。前期的研究发现，急性HIV感染者γδ T细胞表面活化分子的表达显著增加[7,8]，但其抑制和凋亡分子的表达情况还不完全清楚。因此，本研究对急性HIV感染者γδ T细胞活化、抑制、凋亡等表型进行分析，以诠释γδ T细胞在急性HIV感染中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象 选取2015年1月至2016年12月期间，北京佑安医院在男男同性恋人群(Men who have sex with men,MSM)中筛查出的HIV急性期感染者15例。根据Fiebig分期，将急性HIV感染(AHI)分为6个阶段[9,10]，Fiebig Ⅰ-Ⅱ(HIV RNA+，HIV Ab-)：1例；Fiebig Ⅲ-Ⅳ(HIV RNA+，HIV Ab+，WB-/±)：2例；Fiebig Ⅴ-Ⅵ(HIV RNA+，HIV Ab+，WB+，缺少p31条带)：12例。采集患者抗凝血和血浆，用于淋巴细胞数量和病毒载量检测。8例HIV阴性者为健康对照组。研究对象的详细资料见表1。所有参与者均签订知情同意书，本研究已通过首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会的审查。

1.1.2流式抗体 PE标记的抗人Vδ2TCR mAb(IMMU389)(Beckman Coulter公司，美国)；FITC标记的抗人Vδ1TCR mAb(TS8.2)(Pierce公司，美国)；APC标记的抗人γδTCR mAb(B1)、Percp-cy5.5标记的抗人CD38 mAb(HIT2)、PE-cy7标记的抗人CD160 mAb(BY55)、APC-cy7标记的抗人PD-1 mAb(EH12.2H7)、APC-cy7标记的抗人CD95 mAb(DX2)、APC标记的抗人CD262(DR5，TRAIL-R2)mAb[DJR2-4(7-8)]和对应的同型抗体(Biolegend公司，美国)。

1.1.3其他材料 淋巴细胞分离液(天津灏洋生物有限公司，中国)；RPMI1640培养基、胎牛血清(Hyclone公司，美国)；牛血清白蛋白(中国医学科学院生物医学工程研究所，中国)；FACSCalibur TruCount 计数管、CantoⅡ流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.2方法

1.2.1T淋巴细胞计数 采用FACSCalibur TruCount 计数管和多色标记抗体(CD3/CD4/CD8/CD45)标记细胞，流式细胞仪检测分析CD3+、CD4+和CD8+T细胞的百分比和绝对计数。

1.2.2病毒载量检测 血浆病毒载量采用雅培Real-time HIV-1 M2000系统检测，最低检测线为40拷贝/ml。

1.2.3流式细胞术 取新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMCs)，洗涤后加入不同荧光标记的抗人TCRγδ、Vδ1TCR、Vδ2TCR、CD38、PD-1、CD160、CD95和CD262 mAbs，同时设置单阳对照和同型对照，室温避光孵育20 min。洗涤后，加入300 μl 2%多聚甲醛固定液。流式细胞仪采集数据，FlowJo软件分析数据。

2 结果

2.1病例分析 急性HIV感染者平均年龄为(29.4±6.9)岁，平均感染时间为(72.4±40.6)d。健康对照组平均年龄为(30.3±6.3)岁，两组年龄的差异无统计学意义，具有可比性。

2.2急性HIV感染者γδ T细胞及其细胞亚群频率的变化 与健康对照组相比较，急性HIV感染者(AHI)γδ T细胞的比例无显著变化。Vδ1 T细胞的比例较健康对照组显著增加(P=0.031)，而Vδ2 T细胞的比例则显著下降(P=0.033)，见图1。

2.3急性HIV感染者γδ T细胞的活化水平显著增加 与健康对照组相比较，急性HIV感染者CD38+γδ T细胞、CD38+Vδ1 T细胞和CD38+Vδ2 T细胞比例显著增加(P=0.002、P=0.000 6、P=0.004)。此外，在急性HIV感染者中，CD38+Vδ1T细胞的比例显著高于CD38+Vδ2T细胞(P<0.000 1)，而在健康对照组中，CD38+Vδ1T细胞与CD38+Vδ2T细胞比例的差异无显著统计学意义(P=0.279)，见图2。

2.4急性HIV感染者γδ T细胞表面抑制性分子的表达 与健康对照组相比较，急性HIV感染者PD-1+γδ T细胞的比例显著增加(P=0.032)，而PD-1+Vδ1 T细胞和PD-1+Vδ2 T细胞的比例无显著差异(P=0.06、P=0.949)。此外，在健康对照组和急性HIV感染者中，PD-1+Vδ1 细胞的比例均显著高于PD-1+Vδ2 细胞的比例(P=0.028，P=0.000 1),见图3A。而急性HIV感染者CD160+γδ T细胞、CD160+Vδ1 T细胞和CD160+Vδ2 T细胞的比例与健康对照组相比无显著统计学差异。但在急性HIV感染者中，CD160+Vδ1 T细胞的比例显著高于CD160+Vδ2T细胞(P=0.009)，见图3B。

表1健康对照组和急性HIV感染者的基本资料

Tab.1Basiccharacteristicsofhealthycontrols(HCs)andacuteHIV-infectedpatients

GroupnAge(y)Infectiontime(d)CD3+Tcell(cells/μl)CD4+Tcell(cells/μl)CD8+Tcell(cells/μl)CD4/CD8HIV RNALog10copies/mlHCs829.4±6.9NANANANANANAAHI1530.3±6.372.4±40.61 530±541398±1431 057±4440.456±0.2564.45±1.11

Note：NA.Not applied.

图1 健康对照组(n=8)和急性HIV 感染者(n=15)γδ T细胞及其亚群分布的比较Fig.1 Comparisons of frequencies of γδ T cell and their subsets between healthy controls(n=8) and acute HIV-infected patients(n=15)Note:Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

图2 健康对照组(n=8)和急性HIV感染者(n=15)γδ T细胞及其亚群活化水平的比较Fig.2 Comparisons of activation of γδ T cell and their subsets between healthy controls(n=8) and acute HIV-infected patients(n=15)Note:Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

图3 健康对照组(n=8)和急性HIV感染者(n=15)γδ T细胞及其亚群抑制性分子的表达Fig.3 Expression of inhibitors on γδ T cell and their subsets from both healthy controls(n=8) and acute HIV-infected patients(n=15)Note:A.PD-1；B.CD160.Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

图4 健康对照组(n=8)和急性HIV感染者(n=15)γδ T细胞及其亚群凋亡分子的表达Fig.4 Expression of apoptosis markers on γδ T cell and their subsets from both healthy controls(n=8) nd acute HIV-infected patients(n=15)Note:A.CD95；B.TRAIL-DR5.Hollow represents healthy control:γδ T cell(○),Vδ1 T cell(△),Vδ2 T cell(◇);Solid represents acute HIV-infected patients:γδ T cell(●),Vδ1 T cell(▲),Vδ2 T cell(◆).

2.5急性期HIV感染者γδ T细胞表面凋亡分子的表达 与健康对照组相比较，急性HIV感染者CD95+γδ T细胞、CD95+Vδ1 T细胞和CD95+Vδ2 T细胞的比例增加，但差异无显著统计学意义。此外，急性HIV感染者DR5+γδ T细胞的比例较健康对照组显著增加(P=0.048)，而DR5+Vδ1 T细胞和DR5+Vδ2 T细胞的比例与健康对照组相比，差异无显著统计学意义。但在急性HIV感染者中，CD95+Vδ1T细胞和DR5+Vδ1T细胞的比例均显著高于CD95+Vδ2T细胞和DR5+Vδ2T细胞的比例(P=0.001，P=0.027)，见图4。

3 讨论

慢性免疫活化、CD4+T细胞的减少是HIV感染及疾病进展的主要特征[11,12]。急性HIV感染者γδ T细胞、Vδ1和Vδ2 T细胞高度活化，且Vδ2 T细胞比例较健康对照组显著减少。慢性病毒感染中，免疫活化可以导致机体免疫细胞耗竭，抑制分子的表达增加，并与T细胞功能缺陷相关[3,5,13]。然而，急性HIV感染中γδ T细胞抑制性分子的表达还不清楚。本研究结果显示，与健康对照组相比，急性HIV感染者PD-1+γδ T细胞的比例显著增加，而CD160+γδ T细胞的比例无显著变化。研究报道，共刺激分子的表达与细胞的分化状态相关，CD160、PD-1主要表达在记忆性CD4+或CD8+T细胞上[14,15]。本研究尚未对γδ T细胞、Vδ1和Vδ2 T细胞的分化状态进行分析，因此未在急性HIV感染者和健康对照组中发现γδ T细胞及其亚群CD160、PD-1表达的差异。此外，T细胞活化或增殖后，CD160的表达并不上调[15]，这也可以解释本研究中急性HIV感染者γδ T细胞表面CD160表达不上调的原因。研究结果显示，PD-1+记忆性CD4+T细胞比例增加与HIV感染儿童CD4+T细胞增殖能力降低和炎症性细胞因子分泌增加相关[4]。CD160的表达可单独影响CD8+T细胞增殖、穿孔素的表达和细胞因子分泌，而不依赖PD-1的表达[15]。正常情况下，Vδ2 T细胞几乎不表达PD-1，而一旦被激活后，PD-1表达大量增加。PD-1/PD-L1的相互作用通过下调IFN-γ的产生和细胞毒活性而降低Vδ2 T细胞的抗肿瘤活性[16]。但PD-1、CD160等抑制性分子如何调节HIV感染者γδ T细胞及其亚群的功能还需进一步研究。

HIV感染者pDC产生大量的IFN-α，促进TRAIL、DR5、Fas和FasL的表达，进而引起CD4+T细胞凋亡[17-19]。本研究发现，与健康对照组相比，急性HIV感染者γδ T细胞表面CD95(Fas)的表达无显著变化，而TRAIL-DR5的表达显著增加，这可能与急性HIV感染者血浆中存在高水平的IFN-α有关[20]。前期研究发现，AIDS患者γδ T细胞可杀伤自体HIV感染的CD4+T细胞[21]。因此推测，通过TRAIL/TRAIL受体途径，而不是Fas/FaL途径，诱导HIV感染CD4+T细胞凋亡是γδ T细胞杀伤HIV感染的CD4+T细胞的机制之一。此外，本研究显示，急性HIV感染者Vδ2 T细胞的数量减少，活化增加。然而，阻断Fas并不能阻止包膜蛋白诱导的细胞死亡，且gp120也不能改变Vδ2 T细胞Fas和FasL的表达[22]。因此，HIV感染者Vδ2 T细胞数量减少的主要原因并不是活化诱导的细胞凋亡，可能是由于HIV直接感染或HIVgp120与Vδ2 T细胞表面CCR5结合导致的[1,22,23]。

本研究首次在急性HIV感染者中发现Vδ1 T细胞活化、抑制和凋亡分子的表达均显著高于Vδ2 T细胞，表明Vδ1 T细胞在HIV感染及疾病进展中起引更为重要的作用。研究发现，HIV感染疾病快速进展者中，Vδ1T细胞的比例显著增高[7]，并可杀伤HIV感染的CD4+T细胞或旁路CD4+T细胞，引起HIV感染者CD4+T细胞减少，进而加速疾病进展[24,25]。但目前对于Vδ1 T细胞的研究相对较少，且本研究采用的样本量较少，需要在大样本中对结果进行验证，并深入研究Vδ1 T细胞在HIV感染及疾病进展中的机制。

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