不同时间骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑创伤疗效的影响

王英杰 王 晶 石 鑫

(承德医学院，承德 067000)

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种骨髓来源的多功能细胞，具有很强的自我更新和多方向分化的能力；能够在内环境的作用下迁移至受到损伤的组织部位，对组织的结构和(或)功能进行修复；并且具有较强的免疫调节功能，进行异体移植时可避免免疫排斥反应[1]。因此，BMSCs在临床多种疾病治疗中的应用得到了很大的重视。

现阶段的研究显示，创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)后，预防神经细胞的死亡是挽救脑创伤患者最直接最有效的手段[2]。当TBI发生后，创伤性的主要作用位置就在大脑的海马区，无论是原发性的创伤，还是出现继发性的创伤，这些都是左右海马区正常工作的主要诱因[3]。自噬(Autophagy)为所有真核细胞内最为普遍的生理表现，是保证机体内环境相对稳定的状态[4]。有研究表明抑制自噬具有减轻TBI和提高神经功能恢复的作用[5]。本实验通过建立大鼠脑损伤模型，并使用BMSCs进行治疗，检测动物行为学的变化[6]，以及自噬相关蛋白的表达，研究BMSCs在不同时间的移植对大鼠脑损伤治疗效果的影响，为BMSCs在临床上治疗脑损伤提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1动物 BMSCs的供体动物：SPF级幼年雄性SD大鼠6只，3～5周龄，体重90～110 g。BMSCs的受体动物：SPF级成年雌性SD大鼠90只，体重180～220 g，均购自于北京维通利华动物公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分离及培养 使用乙醚麻醉大鼠，然后脱颈处死大鼠，在无菌的条件下将股骨和胫骨分离，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培养基冲洗骨髓腔，并收集冲洗液，1 000 r/min低温离心10 min后弃去上清液，用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基重悬细胞。计数后按1×106cm-2密度接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，48 h后进行第一次换液，第二次以后换液间隔2～3 d 1次。待细胞95%融合时，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例进行传代，细胞传至第3代用于实验[7]。

1.2.2实验动物与分组 SPF级健康成年雌性SD大鼠50只，体质量180～220 g。在实验前让大鼠自由进食饮水，适应性饲养1周。将50只SD雌性大鼠随机分为5组，每组10只：对照组、脑创伤模型组、早期治疗组、中期治疗组、晚期治疗组。治疗组分别在造模成功后的1 d、28 d、56 d 经尾静脉注射BMSCs与DMEM悬液1.0 ml(1×106ml-1)，对照组以及模型组给予等剂量的生理盐水。

1.2.3脑组织形态学检测 大鼠采取腹腔麻醉法，使用10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的剂量对大鼠进行麻醉，麻醉后将大鼠断头，分离脑组织，于视交叉后1和6 mm的位置冠状面切开修整组织块，最后剩下大鼠脑的海马位置，在4%多聚甲醛固定液中固定48 h，按照梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、5 μm连续切片。进行HE染色，光学显微镜下观察，拍照留图。

1.2.4Morris水迷宫测试 对照组、模型组、早、中、晚期治疗组大鼠分别于伤后6、7、8、9 d进行水迷宫测试。检测时，把安全岛采取随机的方式放到水迷宫四个象限(N、S、E、W)中的一个象限中，加水，高过安全岛1 cm，水的温度维持在22℃～24℃，摄像机及计算机会自动追踪大鼠的活动路线，以及寻找时间。180 s内仍没找到安全岛，则潜伏期时间为180 s。

1.2.5免疫印迹法检测LC-3和Beclin-1的表达量 将所获取的大鼠脑海马组织从-80℃超低温冰箱中取出，然后将脑组织剪碎，按照100 mg/ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低温离心15 min，然后凝胶电泳分离后，转移至 PVDF膜上。5% 脱脂奶粉37℃ 封闭 1.5 h，一抗孵育，并在4℃环境下过夜，第二日二抗孵育2 h。用ECL显色液进行曝光，使用Image J软件进行分析，以β-actin作为内参进行半定量分析。

2 结果

2.1BMSCs的形态学观察 原代BMSCs在48 h之内贴壁，以分散的克隆聚集方式增殖，细胞形态基本为均匀星形或梭形，核居中，偶有宽大扁平的多边形细胞。经过BMSCs纯化，其他非贴壁细胞，通过换液逐渐减少。2 周后原代细胞 95% 融合，进行传代。传代后细胞呈现漩涡状和放射状集落生长倾向，随着传代次数增加，细胞形态更为均一，为梭形成纤维细胞样。见图1。

2.2HE染色组织形态学改变 HE染色结果显示，在对照组中脑的组织结构没有发生改变，血管的管腔中没有发现异常，血管的管壁平整，神经细胞形态规则；在创伤后，模型组神经元细胞胞体出现形状的改变，胞浆染色降低，细胞核出现深度染色，能够看到在细胞之间出现了明显的间隙，并且伴有坏死的神经元细胞出现，早、中期治疗组与模型组比较病理改变明显减轻，晚期治疗组没有减轻，有加重趋势。见图2。

图1 BMSCs的形态学观察(× 200)Fig.1 Morphological observation of BMSC(× 200)Note: A.95% BMSCs；B.Primary cells；C.The third passage BMSCs.

2.3Morris水迷宫结果 因为在脑创伤后，大鼠的运动能力会受到一定的影响，所以设置的实验时间在每组创伤后的第6、7、8以及9天进行Morris水迷宫检测。实验结果显示，模型组在伤后第8天和第9天搜索安全岛潜伏期明显要比对照组时间增加。早、中期治疗组在伤后第8天以及第9天搜索安全岛潜伏期要比对照组有显著的缩短，说明大鼠的记忆功能得到了一定的恢复，晚期治疗组搜索安全岛潜伏期与模型组差异不明显。见图3、4和表1。

图2 各组HE结果(×200)Fig.2 Each group of HE results(× 200)Note: A.Control group;B.Model group;C.Early treatment group；D.Middle treatment group;E.Late treatment group.

2.4LC-3和Beclin-1的Western blot检测结果 LC-3结果显示出深浅不同的双条带LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。对照组LC-3和Beclin-1蛋白有微量基础表达。与对照组相比较，模型组LC-3和Beclin-1蛋白的表达有显著升高(P<0.05)；与模型组相比，早、中期治疗组蛋白表达明显减弱(P<0.05)，但仍高于对照组表达量，晚期治疗组与模型组相比较蛋白的表达没有明显的差异。见图5、6。

图3 各组水迷宫运动轨迹Fig.3 Moving track of control group in Morris water mazeNote: A.6 d;B.7 d;C.8 d;D.9 d.

表1水迷宫运动变化数据

Tab.1Movementdataofwatermaze

GroupsTime6 d7 d8 d9 dControl group15.455 6±3.125 313.465 4±3.606 510.321 2±1.512 17.634 1±1.456 3Model group167.357 9±3.102 7131.764 3±4.262 799.256 7±3.423 51)67.792 2±2.897 51)Early treatment group106.881 9±5.122 091.074 3±4.421 953.563 3±3.784 92)31.432 3±1.516 12)Middle treatment group110.778 5±4.564 186.264 8±3.987 457.126 8±3.058 92)27.985 1±2.013 72)Late treatment group159.657 8±4.569 7125.231 4±4.235 890.236 8±3.289 52)60.157 6±3.046 82)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group.

图4 各组水迷宫比较Fig.4 Comparison of delitescence in water maze among groups after injuryNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

图5 各组LC-3的蛋白表达Fig.5 Protein expression of LC-3 in each groupNote: Model group vs control group,#.P<0.05;early treatment and middle treatment group vs model group,*.P<0.05.

图6 各组Beclin-1的蛋白表达Fig.6 Protein expression of Beclin-1 in each groupNote: Model group vs control group,#.P<0.05;early treatment and middle treatment group vs model group,*.P<0.05 .

3 讨论

BMSCs是一种来源于骨髓的多功能细胞，具有很强的自我更新和多方向分化的能力，能够在内环境的作用下迁移到受损伤的组织位置，对组织的结构和功能进行修复；并且拥有较强的免疫调节功能，进行异体移植时能够避免免疫排斥反应[8]。所以，BMSCs在临床许多疾病的治疗中都发挥了关键性的作用。大量研究证实，BMSCs在心脏、肝脏、肺、肾脏等多个组织器官的损伤中发挥着重要的治疗作用。在心肌梗塞、缺血性心脏病等心脏损伤模型中，发现BMSCs可以促进心肌细胞再生、增加新生血管的形成，进而促进损伤的修复[9]。LC-3：微管相关蛋白轻链3(Microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)，是酵母ATG8的同系物，细胞自噬体膜通用标记物，其有两种分子存在形式，即LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ，其中LC3-Ⅱ是自噬体形成的关键分子被广泛用作检测哺乳动物中的自噬活性，LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的比值与自噬体的多少有直接关系[10]。通过免疫蛋白印迹的实验方法能够看到LC-3蛋白的表达可以形成深浅的双条带，即LC-3Ⅰ及LC-3Ⅱ。在正常的细胞里，LC-3Ⅰ和 LC-3Ⅱ都能够被发现，当自噬被激活的状态下，LC-3Ⅱ的蛋白表达会出现升高的趋势。这些促使自噬体的进一步形成。所以LC-3Ⅱ的蛋白表达情况就能够视为自噬是否被激活的标准[11]。

Beclin-1作为自噬的相关基因同样也是哺乳动物中酵母Apg6/Vps30的同系产物，是自噬的相关因子中的重要组成之一，Beclin-1的表达也被用于检测自噬的活性[12]。Beclin-1和磷酸肌醇3激酶(Vps34)相互作用，是吞噬小体形成的关键因素[13]。

本实验的实验结果显示：HE染色结果，模型组神经元细胞胞体发生明显改变，胞浆染色降低，细胞核出现深度染色，并且伴有坏死的神经元细胞出现，早、中期治疗组同模型组比较病理可以看到有明显的减轻，晚期治疗组并不明显，这说明在一定程度上BMSCs的早、中期治疗对大鼠脑创伤后的恢复起到了一定的作用；Morris水迷宫结果显示，在脑创伤后，模型组在搜索安全岛所用的时间明显比对照组时间多，早、中期治疗组的搜索时间要比模型组有了明显的好转，晚期治疗组效果不明显，这说明大鼠脑创伤后通过早、中期的BMSCs治疗，大鼠的空间记忆功能有了一定程度的改善；Western blot检测结果显示，模型组LC-3和Beclin-1蛋白表达出现了显著升高，与模型组相比，早、中期治疗组蛋白表达明显减弱，而晚期治疗组与模型组相比较蛋白的表达没有明显的差异，这进一步说明大鼠脑创伤后通过早、中期的BMSCs治疗对大鼠脑创伤后的恢复起到了一定的作用。经实验初步证实，大鼠在受到脑损伤后，及时给予BMSCs治疗，大鼠在病理改变上有了一定的损伤恢复，在空间学习能力上也有了相对应的加强，这进一步说明了BMSCs的及时应用能够给治疗带来积极的作用。另外，本文只对BMSCs治疗的时间方面，进行了不同时间点的研究，具体在治疗过程中，是否存在着治疗剂量的差别，还有待进一步的研究。

综上所述，本研究证实了BMSCs对创伤性脑损伤的早、中期治疗有明显的作用效果，在创伤性脑损伤的晚期作用效果不明显，为BMSCs面向临床的应用提供了有力的理论和实验依据。

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