补肾益气方通过上调滋养细胞IDO的表达促进母胎界面NK细胞的表型转化①

杨少良 牛甜甜 李明清 王海燕

(复旦大学附属妇产科医院中西医结合妇科,上海 200011)

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)是指连续3次或3次以上于妊娠20周以前发生流产，在育龄期妇女中发病率约5%[1]。复发性流产的病因包括多个方面，除常见的父母染色体异常、抗磷脂抗体综合征、宫腔异常等原因外，另外还有同种免疫、内分泌及环境等因素。目前关于复发性流产的研究众多，但是仍有约50%以上的病例病因不明，而免疫因素可能是不明原因复发性流产的重要原因[2]。复发性流产的治疗主要针对危险因素展开，包括胚胎植入前基因诊断、抗凝治疗、内分泌治疗和免疫治疗等，传统的中药治疗也是不明原因流产患者治疗的一个重要方法。

传统的中医学认为，胎儿能在母体内正常生长发育和成熟，关键在于胎儿和母体相互适应。一方面需要母体肾气充沛、气血充实，另外一方面需要胎儿健康，能从母体获得足够的能量。补肾益气方由菟丝子、桑寄生、杜仲、党参、 白芍、白术、条黄芩、苏梗共8味药组成，具有补肾健脾、益气养血、固胎元的作用。在既往的研究中，补肾益气方对不明原因的复发性流产患者具有良好的治疗作用，但具体机制仍不清楚[3,4]。本文对补肾益气方治疗复发性流产的机制进行了探讨。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 免疫组织化学IDO抗体购自美国R&D公司；免疫组织化学试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司；细胞流式抗体CD56、CD16、IDO购自达科为生物技术有限公司；1-甲基色氨酸(1-MT)购自Sigma-Aldrich；NK细胞分选试剂盒购自美天旎公司。显微镜购自日本Olympus公司;流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；滋养细胞细胞系HTR-8/SVneo由复旦大学附属妇产科医院生殖免疫研究所提供。

1.2方法

1.2.1绒毛组织收集 该项研究已获复旦大学附属妇产科医院伦理委员会批准和认可。所有绒毛组织标本均获取于2015年9月至2016年11月在复旦大学附属妇产科医院行人工流产或流产后刮宫的患者。经患者知情同意后，将绒毛组织在无菌条件下置入装有无血清高糖培养基的离心管中，放置于冰盒内，并于1 h内带回实验室。绒毛组织经4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片。外周血液样本取自健康志愿者，用带有肝素的针管抽取静脉血约10 ml，用于分离NK细胞。

1.2.2外周NK细胞的分离 将外周血加入装有淋巴细胞分离液的无菌长玻管中，外周血与淋巴细胞分离液的比例为1∶1。2 000 r/min离心20 min，吸取白膜层细胞即为外周血单个核细胞(PBMC)。按照NK细胞分选试剂盒说明书的步骤分选NK细胞，用流式细胞仪鉴定所得细胞的纯度。

1.2.3免疫组织化学 将石蜡切片烤片，脱蜡，复水后，95℃抗原修复25 min。3%的过氧化氢孵育10 min后于4℃一抗孵育过夜。经辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后，DAB染色，结晶紫复染、返蓝后与显微镜下观察拍照。

1.2.4含药血清制取 将党参12 g、菟丝子15 g、白术6 g、白芍12 g、杜仲12 g、桑寄生12 g、苏梗 6 g、条黄芪15 g煎煮后过滤，真空抽干制成粉剂，用蒸馏水重悬后灌喂大鼠。将大鼠分为两组，一组灌喂中药复方，一组灌喂生理盐水，灌喂剂量为 16 g/kg。每天灌喂1次，灌喂5 d后处死大鼠，腹主动脉采血，分离血清，保存于-80℃备用。

1.2.5共培养体系建立 HTR-8/SVneo按5×104每孔种于24孔板中，过夜贴壁后加入不同处理因素，包括1-MT,含10%对照血清的培养液，含10%中药血清培养液，10%中药血清培养液联合1-MT等。处理48 h后，弃去培养液，更换新鲜培养液并按1∶1细胞比例加入外周NK细胞，共培养48 h。

1.2.6NK细胞表面分子的检测 收取不同处理组的NK细胞，PBS洗涤，离心，弃上清。每管加入100 μl buffer重悬，根据细胞量加入相应量细胞流式抗体，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤后上机检测。

2 结果

2.1复发性流产患者与正常人工流产孕妇绒毛组织IDO的表达 对正常人工流产孕妇与复发性流产患者绒毛组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，结果显示绒毛组织高表达IDO，且在胞核与胞浆中均有IDO的表达。与复发性流产患者相比，正常人工流产孕妇绒毛组织中的IDO表达明显较高，差异具有显著性(图1)。这一结果表明复发性流产患者绒毛组织中的IDO表达较正常孕妇低。

2.2含药血清对滋养细胞IDO表达的影响 HTR-8/SVneo经对照血清培养液和含药血清培养液处理48 h后，用流式细胞仪检测IDO的表达。实验结果显示，含药血清培养的滋养细胞表达较高水平的IDO。与对照组相比，中药可以有效提高IDO阳性的滋养细胞比例(图2)。

图1 复发性流产患者与正常人工流产孕妇绒毛组织IDO的表达Fig.1 IDO expression in recurrent spontaneous abortion patients and normal pregnant womenNote: A,D.Incubated with PBS;B,E.Incubated with mouse anti-human IDO antibody;C,F.Magnified picture of typical positive position.

图3 滋养细胞对外周NK细胞表型的影响及补肾益气方的调节作用Fig.3 Influence of trophoblast in phenotype of peripheral NK cells and role of Kidney-replenishing herb in this processNote: HTR-8-,1-MT- means peripheral NK cells cultured alone,HTR-8+,1-MT- means peripheral NK cells cultured with HTR-8 without 1-MT,HTR-8+,1-MT+ means peripheral NK cells cultured with HTR-8,which has been treated with 1-MT for 48 hours.Ctrl.Control serum medium;Herb.Herb serum medium;H+1-MT.Herb medium supplemented with 1-MT.NS.P>0.05;*.P<0.01；**.P<0.001;***.P<0.000 1.

图2 含药血清对滋养细胞IDO表达的影响Fig.2 Effect of Kidney-replenishing herb on expression of IDO in trophoblastsNote: A.Control serum group,IDO expression;B.Herb serum treated group,IDO expression;C.Statistical results from A and B,**.P<0.001.

2.3滋养细胞对外周NK细胞表型转化的诱导作用及补肾益气方的调节机制 约90%外周NK细胞表达CD16,经与HTR-8/SVneo共培养后，CD16的表达水平显著下降。当滋养细胞内的IDO活性被1-MT阻断后，NK细胞表达CD16的比例上升。提示滋养细胞具有诱导外周NK细胞向蜕膜NK细胞转变的功能，且IDO在其中发挥了一定的作用。此外，外周NK细胞与滋养细胞共培养后，CD56的平均荧光密度增强，但1-MT对该过程无明显影响，提示滋养细胞对外周NK细胞CD56的调节作用不依赖于IDO(图3A、B)。

与对照血清组相比，中药血清处理后的滋养细胞具有更强的抑制外周NK细胞表达CD16的功能，且这种抑制作用可以被1-MT逆转，提示含药血清可以通过影响滋养细胞IDO的表达调节外周NK细胞的表型转化。同时，含药血清组NK细胞表达的CD56较对照组高，1-MT也不能逆转这一改变(图3C、D)。这些结果表明滋养细胞以IDO依赖的机制诱导外周NK细胞CD16的降低，以IDO非依赖的方式诱导外周NK细胞CD56的升高，补肾益气方可以对这一过程发挥调节作用。

3 讨论

复发性流产是妇产科的常见疾病，因其发病机制复杂多样，且有很大一部分目前尚不能找到明确原因，治疗效果仍很有限。其中，中医药在复发性流产的治疗中起到了一定的作用。在既往的研究中，学者们对补肾益气方在复发性流产治疗中的应用进行了探讨。卢颖莹等[5]利用溴隐亭诱导的流产大鼠模型进行实验，验证了补肾益气方可以明显减少黄体的退化性病理改变、降低大鼠的流产率、增加胚胎数。孙艳玲等[4]的研究结果表明补肾益气方联合黄体酮可以改善复发性流产患者的预后，提高足月分娩率。补肾益气方治疗复发性流产的机制还有待研究，以目前的研究结果看，一方面可能是由于补肾益气方具有一定的免疫调节作用，可以改善机体整体及蜕膜局部的免疫状态，另一方面可能是补肾益气方对机体的内分泌平衡有一定的帮助，可以调节女性下丘脑-垂体-卵巢轴的功能。多项实验表明，补肾益气方对复发性流产患者蜕膜局部及外周血中Treg细胞、Th17细胞的平衡有调节作用，可以上调Treg的比例，增加抗炎性细胞因子IL-10、IL-4的表达，而降低TNF-α、IFN-γ、IL-17的表达，促进形成耐受型的免疫微环境[6-10]。

IDO在正常妊娠的过程中具有重要意义。蜕膜局部的IDO可以诱导Treg细胞的分化，抑制效应性T细胞的增殖和活化，并对多种免疫细胞包括巨噬细胞、B细胞、DC细胞等都具有一定的调节功能，有利于维持母胎界面的耐受状态[9,10]。Zong等[11]的研究表明，IDO可以促进滋养细胞的增殖和侵袭，而不明原因流产患者绒毛组织中IDO表达降低可能是导致不良妊娠结局的原因。Obayashi等[9]认为绒毛组织中IDO的表达量和活性可能在不明原因流产中发挥了重要作用。而IDO对NK细胞的调节作用，可能是由于IDO催化色氨酸代谢为犬尿氨酸及下游代谢产物所引起的局部微环境改变造成的。色氨酸缺乏导致的空载tRNA增多，可以激活细胞内的GCN2激酶，特异性地磷酸化eIF2，降低胞内的蛋白合成水平，抑制免疫细胞的效应[12,13]。犬尿氨酸及下游代谢产物可以通过配体受体结合的方式，向胞内传递信号，调节免疫细胞的状态[14,15]。

NK细胞是蜕膜局部比例最高的一种免疫细胞，在母胎免疫耐受中发挥了重要的作用。妊娠期间NK细胞在母胎界面大量聚集，主要依赖两种方式：一种是外周NK细胞在蜕膜局部趋化因子的作用下向母胎界面移动，一种是蜕膜局部的造血干细胞在局部微环境的调控下分化而成。外周NK细胞的表型主要为CD56+CD16+,而蜕膜NK细胞主要表现为CD56brightCD16dim，并表达杀伤细胞抑制性受体KIR，在滋养细胞表达的非经典的MHCⅠ类分子的启动下，向胞内转导抑制性信号，保护胚胎来源的细胞不被杀伤[16,17]。除此之外，蜕膜NK细胞还表现出与外周NK细胞不一样的功能，它可以分泌多种细胞因子，如IL-4、IL-10等，调控滋养细胞的侵袭，促进胎盘血管形成[18]。蜕膜局部的NK细胞有很大一部分来自于外周，经诱导教育之后其表型发生转化而表现为耐受表型，但具体的机制目前仍有很多没有明确。在本篇文章中，我们验证了滋养细胞可以诱导外周NK细胞的表型向蜕膜表型的改变，并且CD16的转变依赖于滋养细胞IDO，CD56的转变不依赖于IDO。而补肾益气方可以增加滋养细胞IDO的表达，并能通过上调滋养细胞IDO的水平来增强其调节能力。与之相类似的是，补肾益气方可以通过上调滋养细胞IDO的表达抑制外周NK细胞CD16的表达，而补肾益气方对CD56的调节作用则不依赖于滋养细胞IDO的表达。

本文从补肾益气方具有免疫调节作用的角度出发，验证了补肾益气方通过上调滋养细胞IDO的表达，影响了滋养细胞对NK细胞的调节作用，促进了外周NK细胞进入蜕膜局部之后的表型转化，有利于维持蜕膜局部的免疫耐受状态，为补肾益气方治疗复发性流产提供了理论依据。

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