PTEN调控STAT3信号通路影响心肌成纤维细胞增殖的研究

万敏娜 金钟奎 汤 澄

(宜春市人民医院心血管内科，宜春 336000)

糖尿病心肌病是一种慢性疾病，是独立于糖尿病以外的并发症，主要以心肌纤维化、胶原纤维沉积为主要特征，心肌纤维化的主要原因是成纤维细胞过度增殖，细胞外基质大量合成，远远超出降解的速度[1,2]。第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是一种与细胞生长和凋亡等有关的基因，在恶性肿瘤、肺组织纤维化等疾病中具有调控作用，基因敲除PTEN后小鼠心脏和体重之间比例增加，心肌纤维化程度加重，心肌收缩能力降低[3,4]。心肌成纤维细胞表达PTEN，在醛固酮等致病因子的作用下其表达水平下调，PTEN在糖尿病心肌病大鼠模型的心肌组织中表达水平低于正常大鼠[5,6]。信号转导与转录因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)广泛存在于哺乳动物组织器官中，在细胞生长、疾病发生中具有关键作用，STAT3磷酸化水平升高后，可以促进细胞生长，抑制STAT3信号通路后的心肌成纤维细胞增殖能力[7,8]。本研究旨在探讨PTEN对高糖诱导心肌成纤维细胞增殖的影响，以期为研究糖尿病心肌病的发病机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 24 h内出生的乳鼠由江西中医药大学提供；PTEN过表达载体(pSicoR-PTEN)由江西中医药大学实验室构建保存；PTEN、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由上海生工合成；STAT3通路阻断剂AG490为美国MCE产品；RNA提取试剂盒、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒为德国QIAGEN产品；Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶为美国Sigma产品；STAT3一抗、磷酸化的STAT3(p-STAT3)一抗、GAPDH一抗为美国Santa Cruz产品；DAB显色试剂盒为北京Solarbio产品；cDNA合成试剂盒为大连TaKaRa产品；qRT-PCR试剂盒为美国Roche产品；Lipofectamine2000为美国Thermo产品。

1.2方法

1.2.1心肌成纤维细胞分离培养 心肌成纤维细胞分离培养参照文献[9]，将24 h内出生的乳鼠用酒精消毒后，取心脏，放在4℃的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)中洗涤后，加入75%的乙醇溶液，把血细胞去除后，剪碎，加入1倍体积的0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.125%胰蛋白酶，放在37℃的水浴中消化，期间每隔10 min摇晃一次，收集消化液，加入含有10%胎牛血清的DMEM混合后，种植到细胞培养瓶中，放在37℃，5%CO2培养箱中培养。心肌细胞和心肌成纤维细胞的贴壁时间差为60 min。将上清液吸除后，加入新鲜细胞培养液，继续培养。用0.25%的胰蛋白酶消化传代。取第3代细胞用于实验。

1.2.2qRT-PCR检测高糖作用后细胞中PTEN表达水平 取第3代心肌成纤维细胞，分别用含有5.5 mmol/L的D葡萄糖和30 mmol/L的D葡萄糖的细胞培养液培养，记为Control和HG。24 h后，加入Trizol，每个6孔板孔中加入1 ml的Trizol，充分裂解后。加入1/5体积(200 μl)三氯甲烷，充分混合后，4℃，12 000 r/min离心15 min。吸取上清溶液，加入等体积的异丙醇，在室温条件下放置10 min，离心，把上清弃掉，用适量的75%乙醇洗涤后，晾干。用DEPC水溶解以后，紫外分光光度计检测浓度、纯度。反转录合成cDNA，qRT-PCR检测试剂盒检测PTEN的水平，内参基因为GAPDH，ΔΔCt法计算PTEN水平。PTEN上游引物：5′-TGACAGCCATCATGAAAGA-3′，下游引物：5′-CCGCTCTCATCAAAAGGTTCATTC-3′。GAPDH上游引物：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游引物：5′-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3′。实验重复3次，取均值。

1.2.3Western blot检测高糖作用后细胞中PTEN表达水平 按照1.2.2中方法培养收集Control和HG细胞，加入细胞裂解液，在冰上裂解50 min，4℃，16 000 r/min离心15 min，蛋白存在于上清中，用BCA蛋白浓度检测试剂盒对蛋白浓度进行定量检测。蛋白样品与5×上样缓冲液按照4∶1的比例混匀后，100℃孵育5 min。每孔中加入40 μg蛋白，SDS-PAGE电泳初始电压为80 V，电泳0.5 h以后，用120 V 继续电泳。90 V，4℃转膜90 min。5%牛血清白蛋白在室温封闭60 min。加入1∶900稀释的一抗4℃过夜后，加入1∶3 000稀释的辣根过氧化物标记的二抗室温反应1 h，DAB显色，在暗室中曝光，Quantity one分析条带灰度值，以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表达水平。实验重复3次，取均值。

1.2.4细胞转染及分组 心肌成纤维细胞培养至对数期后，把细胞浓度调整到每毫升含有2×105个细胞，种植到6孔细胞培养板中，观察细胞融合度约为60%进行细胞转染。将pSicoR-PTEN和对照pSicoR用Lipofectamine2000转染至细胞中，用含有5.5 mmol/L的D葡萄糖的细胞培养液培养，记为PTEN和NC。转染pSicoR-PTEN后的细胞经含有30 mmol/L的D葡萄糖细胞培养液培养后记为PTEN+HG。Control和HG细胞处理方法同1.2.2。

1.2.5MTT检测细胞增殖 Control、HG、PTEN+HG细胞以每孔加入5 000个细胞种植到96孔细胞培养板。培养24 h以后，每孔中加入20 μl的浓度为5 mg/ml的噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)，在37℃孵育4 h。每组设置5个复孔。将上清吸除以后，每孔中加入二甲基亚砜溶液150 μl，避光，室温反应10 min。用酶标仪检测每孔490 nm的A值。实验重复3次，取均值。

1.2.6Western blot检测STAT3、p-STAT3水平 Control、HG、PTEN+HG细胞培养24 h后，Western blot检测细胞中STAT3、p-STAT3水平，STAT3、p-STAT3一抗以1∶800和1∶500稀释。步骤同1.2.3。实验重复3次，取均值。

1.2.7STAT3通路阻断剂AG490对细胞增殖影响 转染pSicoR-PTEN后的心肌成纤维细胞用含有30 μmol/L的STAT3通路阻断剂AG490和含有30 mmol/L的D葡萄糖的细胞培养液培养记为PTEN+HG+AG490。 PTEN+HG、PTEN+HG+AG490细胞培养24 h后，MTT检测细胞增殖，Western blot检测细胞中STAT3、p-STAT3水平。步骤同1.2.3和1.2.5。实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1高糖作用后心肌成纤维细胞中PTEN水平 如图1和表1所示，Control、HG细胞中PTEN mRNA水平依次为：1.00±0.10、0.26±0.03，PTEN蛋白水平为：1.08±0.11、0.34±0.04。HG细胞中PTEN mRNA水平和蛋白水平均明显低于Control，差异具有统计学意义(t1=42.724,t2=10.951,P<0.05)。高糖作用后的心肌成纤维细胞中PTEN表达水平下降。

2.2细胞转染后PTEN表达水平 结果如图2和表2所示，Control、NC、PTEN细胞中PTEN mRNA水平依次为：1.00±0.09、1.03±0.07、1.87±0.16，PTEN蛋白水平为：0.98±0.08、0.96±0.12、1.68±0.14。NC细胞中PTEN mRNA水平和蛋白水平与Control相比差异无统计学意义(t1=0.364,t2=0.211,P>0.05)。PTEN细胞中PTEN mRNA水平和蛋白水平明显高于Control，差异有统计学意义(t1=10.568,t2=7.388,P<0.05)。心肌成纤维细胞转染pSicoR-PTEN后能够提高细胞中PTEN基因和蛋白水平，转染对照载体pSicoR对细胞中PTEN基因和蛋白水平没有影响。

图1 Western blot检测高糖作用后细胞中PTEN水平Fig.1 Level of PTEN in cells after high glucose detected by Western blot

GroupsPTEN mRNAPTEN proteinControl1.00±0.101.08±0.11HG0.26±0.031)0.34±0.041)

Note：Vs control，1)P<0.05.

2.3PTEN对高糖诱导的细胞增殖影响 如表3所示，Control、HG、PTEN+HG细胞A值依次为：0.32±0.04、0.54±0.06、0.41±0.04。HG细胞A值与Control相比明显升高，差异具有统计学意义(t=5.660,P<0.05)。PTEN+HG细胞A值明显低于HG，差异具有统计学意义(t=3.344,P<0.05)。高糖诱导心肌成纤维细胞增殖，PTEN可以减弱高糖诱导的细胞增殖作用。

2.4PTEN对高糖环境细胞中STAT3、p-STAT3水平影响 如图3和表4所示，Control、HG、PTEN+HG细胞STAT3水平依次为：0.62±0.05、0.60±0.08、0.61±0.06，p-STAT3水平依次为：0.14±0.02、0.52±0.06、0.28±0.03。HG细胞p-STAT3水平与Control相比明显升高，差异具有统计学意义(t=11.516,P<0.05)。 PTEN+HG细胞p-STAT3水平明显低于

图2 Western blot检测转染后细胞中PTEN蛋白水平Fig.2 Level of PTEN protein in transfected cells detected by Western blot

GroupsPTEN mRNAPTEN proteinControl1.00±0.090.98±0.08NC1.03±0.070.96±0.12PTEN1.87±0.161)1.68±0.141)F71.97137.455P0.0000.000

Note：Vs control,1)P<0.05.

GroupsA valueControl0.32±0.04HG0.54±0.061)PTEN+HG0.41±0.042)F16.191P0.004

Note：Vs Control,1)P<0.05；vs HG,2)P<0.05.

图3 Western blot检测 PTEN对细胞STAT3、p-STAT3水平影响Fig.3 Effect of PTEN on cell STAT3,p-STAT3 level detected by Western blot

GroupsSTAT3p-STAT3Control0.62±0.050.14±0.02HG0.60±0.080.52±0.061)PTEN+HG0.61±0.060.28±0.032)F0.07267.837P0.9310.000

Note：Vs Control,1)P<0.05；vs HG，2)P<0.05.

HG，差异具有统计学意义(t=7.273,P<0.05)。高糖诱导心肌成纤维细胞中STAT3磷酸化，PTEN降低高糖环境细胞中STAT3磷酸化水平。

2.5抑制STAT3信号通路对细胞增殖影响 结果见图4和表5中所示，PTEN+HG、PTEN+HG+AG490细胞A值依次为：0.46±0.04、0.35±0.03，STAT3水平依次为：0.84±0.08、0.86±0.09，p-STAT3水平依次为：(0.23±0.02)、(0.11±0.01)。PTEN+HG+AG490细胞p-STAT3水平和A值明显降低，与PTEN+HG相比，差异具有统计学意义(t1=3.811,t2=9.295,P<0.05)。抑制STAT3信号通路可以进一步降低心肌成纤维细胞增殖能力，其与PTEN具有协同作用，可以抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖。

图4 Western blot检测各组细胞中STAT3、p-STAT3水平Fig.4 STAT3，p-STAT3 levels of cells in each group detected by Western blot

GroupsA valuep-STAT3STAT3PTEN+HG0.46±0.040.23±0.020.84±0.08PTEN+HG+AG4900.35±0.031)0.11±0.011)0.86±0.09

Note：Vs PTEN+HG,1)P<0.05.

3 讨论

人类PTEN基因定位于染色体10q23，其由8个内含子、9个外显子组成，其编码的蛋白质由403个氨基酸组成，在细胞浆、细胞核和细胞膜均有表达，其含有的PDZ结构域能够特异性的识别PDZ基序蛋白，从而调控三磷酸磷脂酰的活性，影响细胞内信号转导[10-12]。PTEN与心血管系统疾病发生有关，与心力衰竭、心肌收缩、心肌缺血再灌注、糖尿病心肌病等关，其编码的蛋白质具有蛋白和脂质磷酸酶活性，能够抑制细胞的生长[13,14]。研究显示，PTEN在心肌肥厚大鼠模型中表达上调，是一种抗心肌肥厚因子，基因敲除PTEN的小鼠心脏的外观变大，出现明显的心肌纤维化[15,16]。付兴根等[17]在研究螺内酯对糖尿病心肌病大鼠的影响时发现，糖尿病心肌病大鼠心肌组织中的PTEN mRNA和蛋白水平明显低于正常大鼠，PTEN参与糖尿病心肌病发生过程。本研究结果显示，高糖作用后的心肌成纤维细胞中PTEN水平下降，心肌成纤维细胞增殖能力增加，这与上述报道相符合，说明PTEN参与糖尿病心肌病的发生过程。

STAT3能够促进细胞增殖，在心力衰竭、缺血再灌注等中具有保护作用，在糖尿病心肌病中过度激活[18-20]。STAT3是STATs家族中的一员，而STATs家族与细胞增殖、分化、生长、凋亡等有关，是目前研究最多的信号通路之一，STAT3蛋白大小为89～92 kD，其含有多个结构域，如：DNA结合区域、螺旋区域、连接区域、C端转录活化区域和SH2结构域等，正是由于这些结构域，其在细胞正常生物学特性维持中具有重要作用[21-25]。STAT3在受到细胞外和细胞内的相关因子作用后，STAT3磷酸化，而2个磷酸化的STAT3可以形成二聚体后转移至细胞核内，发挥信号传递的作用[26-28]。STAT3与糖尿病心肌病有关，无论是在Ⅰ型糖尿病还是Ⅱ型糖尿病中均发现STAT3信号通路异常，并且与间质纤维化等有关，在高糖作用后的心肌成纤维细胞中发现p-STAT3水平升高[27,29]。PTEN和STAT3作为重要的调控细胞生长因子，二者之间也存在一定的联系[30]。

本研究结果显示，心肌成纤维细胞经高糖作用后，细胞中的STAT3磷酸化水平升高，而PTEN表达水平升高后，经高糖诱导后的细胞中STAT3磷酸化有所降低。进一步用STAT3信号通路抑制剂处理后发现，抑制STAT3信号通路和过表达PTEN具有协同作用，都能够抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖，说明PTEN通过抑制STAT3信号通路降低高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖能力。

综上，高糖诱导心肌成纤维细胞增殖，降低细胞中PTEN表达水平，过表PTEN后可以降低高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖水平，作用机制与抑制STAT3信号通路有关。本研究明确了PTEN在高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖中的作用，为探讨糖尿病心肌病及心肌纤维化的发病机制奠定了基础。本研究存在一定的局限性，只在心肌成纤维细胞中进行了探讨，后续试验中会继续探讨PTEN在心肌细胞、平滑肌细胞等多种细胞中的作用。

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