祛痰化瘀方对脱氢表雄酮诱导PCOS模型大鼠性激素及卵巢纤维化相关因子的影响*

刘卫红，崔 琳，申意彩，丁 玉，马春芬

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046；3.黄河科技大学，河南 郑州 450006; 4.河南省中医院，河南 郑州 450002)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是以排卵障碍、卵巢呈多囊性变化、高雄激素血症等为主要特征的内分泌紊乱综合征[1]。PCOS病因复杂，致病原因至今仍不明确。在众多免疫细胞因子中，转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)是公认的组织器官纤维化的关键因素，被认为与PCOS发病密切相关，可能参与了PCOS的卵泡发育、卵泡膜细胞分化、雄激素产生、胰岛素抵抗及卵巢组织纤维化等过程。有研究[2]发现，TGF-β1 能促使PCOS模型小鼠的卵巢纤维母细胞胶原生物合成而导致卵巢纤维化。祛痰化瘀方临床治疗PCOS有较好疗效。本研究采用脱氢表雄酮造模法制作大鼠PCOS模型，研究祛痰化瘀方对PCOS模型大鼠动情周期、激素水平及卵巢纤维化相关因子的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物

雌性SPF级21日龄大鼠80只，体质量(50±20)g，由河南省实验动物中心提供，许可证号SYXK(豫)2010-0002，合格证号41003100001497。

1.2 药品、试剂与仪器

祛痰化瘀方由桂枝、茯苓、牡丹皮、炒桃仁、赤芍、车前草等组成，由河南中医药大学第一附属医院提供，水煎浓缩至质量分数为2.27 g/mL，4.54 g/mL，4 ℃ 冰箱保存备用。血清促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)ELISA试剂盒，由郑州安图生物工程股份有限公司提供，96孔，批号20150110，20150201，20150104；TGF-β1，Pepro Tech公司，产品编号HB018834；免疫组化试剂盒、DAB显色液，均购自武汉博士德生物工程有限公司，编号依次为SX001352、SX000252；MK3型全自动酶标板分析仪，Multiskan；CK40型倒置显微镜，Olympus；TB-718E型生物组织自动包埋机，湖北泰维科技实业有限公司；Leica RM2245轮转式石蜡切片机，产地德国。

1.3 模型的建立、分组与给药

雌性SPF级21日龄大鼠58只，自22日龄开始模型组每天颈背部皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)试剂(60 μg/g体质量+0.2 mL注射油剂)，连续20 d ，建立PCOS大鼠模型。空白对照组22只大鼠每天皮下注射0.2 mL注射油剂。造模结束后，分别从模型组、空白对照组各随机选取10只大鼠进行模型评估。

造模结束后，将模型组剩余48只大鼠随机分为二甲双胍组，模型对照组，祛痰化瘀方高、低剂量组，将空白对照组剩余12只大鼠作为空白对照组。各组一同进行药物干预实验。根据Bios法计算大鼠千克体质量剂量，按大鼠体质量计算用药剂量。祛痰化瘀方高、低剂量组依次给以4.54，2.27 g/mL生药灌胃，二甲双胍组以0.2 g/kg灌胃，空白对照组、模型对照组灌胃等体积生理盐水，1 d 1次，连续28 d。

1.4 检测指标

1.4.1 动情周期

经祛痰化瘀方连续灌胃28 d后，各组大鼠均于每日清晨9:00进行阴道脱落细胞涂片并进行观察，连续10 d，镜下观察正常组和模型组并进行比较。

1.4.2 血清FSH、LH、T水平

灌胃结束后，各组大鼠禁食水12 h，腹主动脉取血5 mL，2 000 r/min离心20 min，分离血清，-20 ℃保存，检测血清FSH、LH、T水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 卵巢间质TGF-β1表达

腹主动脉取血后，取大鼠左侧卵巢，置于多聚甲醛固定，以卵巢最大平面为待检测面，常规石蜡包埋，行免疫组织化学染色。每个卵巢标本于30倍镜下选择5个视野进行拍照，各组大鼠随机选取30个镜下视野测定卵巢间质TGF-β1表达。

1.5 统计学方法

2 结 果

实验过程中，模型对照组和祛痰化瘀方低剂量组各有1只大鼠死亡，经解剖，发现是灌胃时误入肺部造成。

2.1 动情周期

阴道涂片结果：祛痰化瘀方2个剂量组和二甲双胍组的大鼠恢复规律的动情周期，而模型对照组大鼠仍无明显的动情周期或动情周期延长。

2.2 各组大鼠FSH、LH、T水平对比

FSH水平：与模型对照组对比，空白对照组和药物组血清FSH水平升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与二甲双胍组对比，祛痰化瘀方高剂量组的FSH降低，差别有统计学意义(P<0.05)；低剂量组的FSH较之差别无统计学意义(P>0.05)。祛痰化瘀方低剂量组FSH水平较高剂量组升高，但差别无统计学意义(P>0.05)。 LH水平：与模型对照组对比，空白对照组、二甲双胍组、祛痰化瘀方高剂量组血清LH水平均降低，差别有统计学意义(P<0.01);祛痰化瘀方低剂量组较之差别无统计学意义(P>0.05)。祛痰化瘀方低剂量组LH高于二甲双胍组(P<0.01)，祛痰化瘀方高剂量组LH水平稍高于二甲双胍组(P<0.05) 。T水平：与模型对照组对比，空白对照组和祛痰化瘀方高剂量组血清T水平降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组 别动物数/只FSH/(IU·L-1)LH/(IU·L-1)T /(μg·L-1)空白对照组122.93±0.60***##△△5.68±0.30***#△△△1.57±0.27**###△△△模型对照组112.06±0.54###△△△6.99±0.54***###△4.01±3.86#△二甲双胍组123.58.±0.61***△5.33±0.55***###△△△2.11±0.33*△祛痰化瘀方低剂量组113.60±0.87#***6.54±0.50*###△△△2.05±0.45*#祛痰化瘀方高剂量组122.94±0.86***##△5.91±0.43***##△△△1.68±0.30**###△△

注：与模型对照组对比，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；与二甲双胍组对比，#P>0.05，##P<0.05，###P<0.01；与祛痰化瘀方低剂量组对比，△P>0.05，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.3 各组大鼠卵巢间质TGF-β1表达水平对比

二甲双胍组、祛痰化瘀方2个剂量组、空白对照组大鼠的TGF-β1与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)，说明PCOS大鼠卵巢形态变化与TGF-β1有关。祛痰化瘀方高剂量组大鼠的TGF-β1与二甲双胍组对比，差别有统计学意义(P<0.01);而祛痰化瘀方低剂量组与二甲双胍组对比，差别无统计学意义(P>0.05)。表明：在治疗卵巢纤维化方面，祛痰化瘀方高剂量组效果最好，二甲双胍组次之，祛痰化瘀方低剂量组效果不如二甲双胍组。见表2。

组 别动物数/只OD(光密度值)空白对照组301.52±0.25***###△△△模型对照组305.55±3.32###△△△二甲双胍组303.42±1.43***△祛痰化瘀方低剂量组303.75±1.47***###△△△祛痰化瘀方高剂量组301.80±0.75***###△△△

注：与模型对照组对比，***P<0.01；与二甲双胍组对比，###P<0.01；与祛痰化瘀方低剂量组对比，△P>0.05，△△△P<0.01

3 讨 论

多囊卵巢综合征是一种病因复杂的内分泌紊乱性疾病。西医学认为：促黄体生成素及雄激素升高是PCOS患者的基本病理生理特点，是严重影响患者生殖功能的根本原因。过高的促黄体生成素水平，刺激卵巢泡膜细胞功能亢进，引起卵巢多囊性改变及高雄激素血症；卵泡激素调控卵巢颗粒细胞的功能受阻，引起月经紊乱、排卵异常及生育障碍[3]。近年来,国内不少研究均显示：TGF-β1参与PCOS的发生及发展，卵巢的卵泡膜和颗粒细胞可产生、分泌 TGF-β1，通过自分泌和旁分泌的调节方式，加强由FSH诱导的雌激素的分泌过程。崔蓉等[4]发现：PCOS 组外周血及腹腔液中 TGF-β1 含量高于正常对照组，差别有统计学意义(P<0.01)。Ong VH[5]认为： PCOS 卵巢纤维化及包膜增厚与 TGF-β1相关。本实验通过观察TGF-β1在各组大鼠卵巢中的表达发现:在PCOS模型大鼠间质细胞中TGF-β1的表达明显高于空白对照组、祛痰化瘀方高、低剂量组及二甲双胍组(P<0.01)，这与文献报道结果一致[6]。

根据PCOS的临床表现可将其归属于中医学“月经后期”“闭经”“崩漏”“不孕”“癥瘕”等范畴。发病主要与肾、肝、脾相关，痰湿阻滞可导致物质代谢障碍，瘀久化热从而产生湿热内阻的征象，进而影响血液流通或导致血液黏稠度增高，从而形成血瘀。瘀血、痰湿停于肌肤则形体肥胖、多毛、痤疮；停于子宫、卵巢就会出现卵巢包膜增厚，排卵障碍。有研究[7-9]表明:没有血瘀证表象的的PCOS患者在治疗中适当运用活血化瘀中药可以增加卵巢组织局部的血流量，使卵巢包膜厚度变薄，促进卵泡发育成熟以及诱发排卵、促黄体发育，提高治疗效果。由此得知：在PCOS发病中，血瘀是重要的致病因素。PCOS患者多肥胖，肥胖之人多痰湿，“脾虚不运，痰湿阻滞”是肥胖的根本[10]。有文献[11]报道：PCOS的患者减轻原来体质量的5%就有望恢复月经、排卵，甚至有妊娠的可能。现代药理研究[12]发现：利湿祛痰中药具有降脂功能，可以通过激活蛋白激酶抑制肝细胞中三酰甘油合成，从而降低血脂水平，改善高胰岛素血症。马春芬教授根据丰富的临床经验，自拟祛痰化瘀方治疗PCOS疗效显著，方中败酱草、车前草、野菊花、生薏苡仁合用，可清热解毒，化痰除湿；泽泻、牡丹皮、桃仁、三棱、莪术配伍，可清热凉血，破瘀通经；赤芍、茯苓、桂枝三药合用，可祛瘀逐水，温阳散结；甘草调和诸药。全方共奏清热利湿、通调化痰、活血消瘀之效。实验结果显示：通过对大鼠阴道涂片的观察发现，PCOS大鼠经过祛痰化瘀方及二甲双胍治疗后，动情周期基本恢复规律；血清LH升高变化与文献报道一致，且祛痰化瘀高剂量组LH水平高于二甲双胍组，差别有统计学意义(P<0.05)；二甲双胍、祛痰化瘀方高剂量、祛痰化瘀方低剂量对多囊卵巢综合征大鼠升高的FSH水平均有疗效，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)。祛痰化瘀方高剂量组、空白对照组大鼠血清T水平与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。祛痰化瘀方高剂量组卵巢间质TGF-β1的表达降低最为明显，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)；低剂量组与二甲双胍组对比，差别无统计学意义(P>0.05)。

综上所述，祛痰化瘀方是治疗多囊卵巢综合征的有效方剂，可以降低PCOS模型大鼠血清促黄体生成素水平和睾酮水平，恢复大鼠动情周期，恢复排卵功能，且祛痰化瘀方高剂量较低剂量降促黄体生成素效果更理想，能升高PCOS大鼠血清促卵泡生成素水平，降低TGF-β1在PCOS大鼠卵泡模细胞及间质细胞中的表达，使包膜增厚、间质纤维化的卵巢趋于正常。在治疗卵巢纤维化方面，祛痰化瘀方高剂量组效果最好，二甲双胍组次之。

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