黄秋葵总黄酮对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制研究

杜战国，魏 玉，龚 曼，李彦灵，禹建春，郭全建

(1.驻马店市妇幼保健院，河南 驻马店 463000；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046；3.新乡医学院三全学院，河南 新乡 453003；4.驻马店市第六人民医院，河南 驻马店 463715)

心血管疾病是目前危害人类健康的常见疾病之一。目前研究表明，心血管疾病主要与血管内皮细胞功能紊乱有关[1]。氧自由基引起的过氧化反应是导致血管内皮紊乱的重要原因[2]。由于中药的多成分、多靶点的独特优势，现在研究热点多从植物中寻找天然的抗氧化活性物质。黄秋葵(Abelmoischusesculentus)为锦葵科秋葵属咖啡黄葵植物，又名羊角豆，为一年生草本植物。现有研究表明，黄秋葵中黄秋葵总黄酮具有良好的抗氧化活性[3]，但其抗氧化机制目前研究较少。本研究采用过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)氧化应激损伤模型，探讨黄秋葵总黄酮的抗氧化作用及其作用机制。

1 材料

1.1 细胞 HUVECs：中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2 仪器 371型CO2培养箱：美国THERMO公司；BIO-RAD550型全自动酶标仪：美国RAPIM公司；CKX41倒置荧光显微镜：日本Olympus；5417D台式高速离心机：德国Eppendorf；Tanon4100凝胶成像系统：上海天能公司；DYY-7C电泳仪、DYCZ-24DN小型垂直电泳槽：北京六一。

1.3 药物与试剂 黄秋葵果实购自新乡农贸市场，经新乡医学院三全学院李彦灵老师鉴定为锦葵科秋葵属黄秋葵(Abelmoischusesculentus)，取黄秋葵果实，烘干后，称取100.05 g，95%乙醇80 ℃回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至干燥，所得粉末为黄秋葵总黄酮，得率为1.25%。MTT：美国Sigma；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测试盒：南京建成公司；兔抗人一抗内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)：北京中杉金桥公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒：上海圣研生物科技有限公司；高灵敏度化学发光检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；内皮素-1(endothelin-1，ET-1)ELISA试剂盒：美国R&D公司；辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体、抗β-actin兔单克隆抗体：北京康为世纪生物科技有限公司。

2 方法

2.1 黄秋葵总黄酮对过氧化氢诱导的氧化应激损伤的保护作用 取对数生长期的HUVECs细胞，胰蛋白酶消化、离心调整细胞浓度为1×105/mL，于96孔板中每孔接种100 μL，贴壁后，分别加入终浓度为0.1、0.5、1、3、5 mg/mL黄秋葵总黄酮，阳性对照组加入10 μmol/L依达拉奉，空白对照组和模型组加入等容量的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)，孵育48 h后，加入终浓度为1 200 μmol/L的过氧化氢，空白对照组加入PBS，培养箱中继续培养8 h[4]，测定OD值，计算HUVECs细胞存活率。存活率=(各实验组OD值/正常对照组OD值)×100%。

2.2 二氯荧光乙酰乙酸盐法检测细胞ROS水平 取对数生长期的HUVECs细胞，胰蛋白酶消化、离心调整细胞浓度为1×105/mL，每孔接种3 mL于6孔板爬片中，贴壁后，分别加入终浓度为0.5、1、3 mg/mL黄秋葵总黄酮，阳性对照组加入10 μmol/L依达拉奉，空白对照组和模型组加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入终浓度为1 200 μmol/L的过氧化氢，空白对照组加入PBS，培养箱中继续培养8 h，弃去培养基，加入含DCFH-DA的无血清培养基，室温下避光孵育20 min，取出封片，荧光显微镜观察，Image J软件分析荧光定量。

2.3 SOD、MDA、NO含量测定 取对数生长期的HUVECs细胞，胰蛋白酶消化、离心调整细胞浓度为1×104/mL，每孔接种2 mL于12孔板中，贴壁后，分别加入终浓度0.5、1、3 mg/mL黄秋葵总黄酮，阳性对照组加入10 μmol/L依达拉奉，空白对照组和模型组加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入终浓度为1 200 μmol/L的过氧化氢，空白对照组加入PBS，培养箱中继续培养8 h，收集细胞上清液，按照试剂盒说明书测定SOD、MDA、NO含量。

2.4 ELISA法检测细胞上清液中ET-1含量 取对数生长期的HUVECs细胞，胰蛋白酶消化，离心，调整细胞浓度为1×104/mL，每孔接种2 mL于12孔板中，贴壁后，分别加入终浓度0.5、1、3 mg/mL黄秋葵总黄酮，阳性对照组加入10 μmol/L依达拉奉，空白对照组和模型组加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入终浓度为1 200 μmol/L的过氧化氢，空白对照组加入PBS，培养箱中继续培养8 h，收集细胞上清液，每孔加入待测细胞上清液50 μL；样品孔中加入40 μL样品稀释液和10 μL样品，空白孔除外；用封板膜封板后，37 ℃孵育反应30 min；洗涤，每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外；温育、洗涤、显色在450 nm测定各孔的OD值，根据样品的OD值计算ET-1含量。

2.5 Western blot法测定细胞中eNOS的表达水平 取对数生长期HUVECs细胞，胰蛋白酶消化、离心调整细胞浓度为1×105/mL，接种于6孔板内，每孔接种3 mL细胞悬液，待贴壁后，分别加入终浓度为0.5、1、3 mg/mL黄秋葵总黄酮，阳性对照组加入10 μmol/L依达拉奉，空白对照组和模型组加入等容量的PBS，孵育48 h后，加入终浓度为1 200 μmol/L的过氧化氢，空白对照组加入PBS，培养箱中继续培养8 h，弃去上清，每孔加入100 μL蛋白裂解液，混合均匀后4 ℃，12 500×g离心20 min。调整总蛋白含量，取上清后加入5倍蛋白上样缓冲液，SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜，BSA(5 g/L)封闭1 h，加入第一抗体eNOS(1∶800)，β-actin(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，后使用TBS-T漂洗。加入二抗IgG-HRP(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST漂洗后进行化学发光，暗室显影，使用Tanon4100凝胶分析系统对蛋白条带进行分析。

3 结果

3.1 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs存活率的影响 与正常对照组比较，模型组HUVECs存活率显著降低(P<0.05)；黄秋葵总黄酮可显著提高过氧化氢损伤的HUVECs存活率，其中1、3、5 mg/mL组与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，但5 mg/mL黄秋葵总黄酮组与3 mg/mL黄秋葵总黄酮组HUVECs存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。因此，后续试验仅研究0.5、1、3 mg/mL黄秋葵总黄酮的作用。见表1。

表1 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs存活率的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs中ROS水平的影响 与正常对照组比较，模型组ROS水平显著升高(P<0.05)；黄秋葵总黄酮各剂量组均能显著降低ROS水平(P<0.05)。见表2。

3.3 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs氧化应激损伤相关指标的影响 与正常对照组比较，模型组HUVECs中SOD、NO水平显著降低(P<0.05)，MDA、ET-1水平升高(P<0.05)；与模型组比较，黄秋葵总黄酮0.5 mg/mL可显著降低MDA水平(P<0.05)；黄秋葵总黄酮1、3 mg/mL可显著升高HUVECs中SOD、NO水平(P<0.05)，显著降低MDA、ET-1水平(P<0.05)。见表3。

表2 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs中ROS水平的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表3 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs氧化应激损伤相关指标的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.4 黄秋葵总黄酮对过氧化氢损伤的HUVECs中eNOS蛋白表达水平的影响 与正常对照组比较，模型组HUVECs内eNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，黄秋葵总黄酮1、3 mg/mL可显著增加过氧化氢损伤的HUVECs内eNOS蛋白表达水平(P<0.05)。见图1。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.阳性对照组；D. 0.5 mg/L黄秋葵总黄酮组；E. 1 mg/L黄秋葵总黄酮组；F. 3 mg/L黄秋葵总黄酮组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧化和抗氧化过程之间的不平衡，其与许多疾病的发病密切相关[5]。氧化应激在心血管疾病的病理生理机制中起重要作用。自由基和氧化细胞损伤的增加与动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、糖尿病和高胆固醇血症等心血管疾病有关。越来越多的研究表明，抗氧化剂可改善血管内皮功能，通过预防低密度脂蛋白中脂质过氧化，对血管内皮依赖性舒张反应与内皮细胞白细胞相互作用的调节增强[6]。本实验使用过氧化氢刺激内皮细胞建立内皮细胞氧化损伤体外模型研究黄秋葵总黄酮的抗氧化和对内皮细胞的保护作用，研究结果表明，过氧化氢引起的氧化应激损伤使HUVECs的存活率显著降低，ROS水平显著升高(P<0.05)；黄秋葵总黄酮可显著提高氧化应激损伤的HUVECs的存活率，降低细胞ROS水平(P<0.05)，表明黄秋葵总黄酮具有较强的抗氧化作用。

SOD和MDA是判断氧化应激情况的一对重要指标，SOD是抑制过氧化物产生的重要的抗氧化酶，MDA是脂质过氧化物，可以对细胞产生损伤作用[7]。本实验中模型组SOD水平显著下降，MDA水平显著升高，经黄秋葵总黄酮作用后，SOD水平显著升高，MDA水平显著下降。ET-1和NO是由血管内皮细胞合成的反映内皮细胞功能状态的物质。ET-1可以收缩血管[8]，NO可以扩张血管，当血管内皮损伤时，ET-1合成水平增高，NO水平降低[9]。本实验研究结果表明，过氧化氢损伤内皮细胞使ET-1水平增高，NO水平降低，黄秋葵总黄酮可降低ET-1水平，升高NO水平，起到保护内皮细胞的作用。

eNOS是一氧化氮合酶的一种，主要合成和释放NO[10]。本实验中模型组eNOS表达显著降低，而1、3 mg/L黄秋葵总黄酮可显著上调eNOS的表达，表明黄秋葵总黄酮可通过调节eNOS的表达起到保护血管内皮细胞的作用。

黄秋葵总黄酮可保护由过氧化氢诱导的HUVECs氧化应激损伤，其机制可能与调节SOD、MDA、ET-1、NO氧化应激相关因子，降低ROS水平，调控内皮细胞功能相关蛋白eNOS的表达有关。本研究通过体外实验进一步验证了黄秋葵总黄酮抗氧化作用，初步探讨了其保护血管内皮细胞的机制，为黄秋葵总黄酮的应用提供了基础数据，其深入的机制还有待于进一步研究。

参考文献：

[1] 何洁英,王汝上,何洁宝,等.郁金醇提取物对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(3):223-225.

[2] 王均鹏,孟丽霞,潘黎明,等.抗衰老Klotho蛋白对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用及其机制[J].中国动脉硬化杂志,2017,25(4):347-354.

[3] 李孟秋,翟俊乐,田欢,等.黄秋葵提取物体外抗氧化活性的研究[J].中国食品添加剂,2015(10):65-69.

[4] 李琦,陈熹,阚晓溪,等.复方银杏叶颗粒改善人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的作用及其机制研究[J].中国中药杂志,2016,41(4):722-727.

[5] WANG X Q, HE X M, DENG X,et al. Roles of miR-4463 in H2O2-induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells[J]. Mol Med Rep,2017,16(3):3242-3252.

[6] SAFAEIAN L, GHANNADI A, JAVANMARD S H, et al. The effect of hydroalcoholic extract of Ferula foetida stems on blood pressure and oxidative stress in dexamethasone-induced hypertensive rats[J].Res Pharm Sci,2015,10(4):326-334.

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[8] 李小红,郭凤霞,杨沁,等.自噬干预对低剪切应力下血管内皮细胞eNOS和ET-1表达的影响[J].中国动脉硬化杂志,2014,22(9):875-880.

[9] 秦汉,胡志希,李琳,等.雪莲通脉丸对冠心病气虚血瘀证小鼠血管内皮细胞功能相关指标ET-1、NO、ACE的影响[J].湖南中医药大学学报,2016,36(2):25-28.

[10] 李先伟,郝伟,刘艳,等.红杉醇对2型糖尿病大鼠主动脉NOX4及eNOS表达的影响[J].药学学报,2014,49(3):329-336.

(收稿日期：2018-01-08；编辑：姚实林)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids fromAbelmoschusesculentuson oxidative stress injury induced by hydrogen peroxide (H2O2) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).MethodsMTT assay was used to investigate the protective effect of total flavonoids fromAbelmoschusesculentuson HUVECs. Spectrophotometry was used to measure the content of superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), and nitric oxide (NO). ELISA was used to measure the content of endothelin-1 (ET-1) in cell supernatant. DCFH-DA was used to measure the level of reactive oxygen species (ROS). Western blot was used to measure the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS).ResultsTotal flavonoids fromAbelmoschusesculentusincreased the survival rate of HUVECs with oxidative stress injury, the activity of SOD, and the level of NO; meanwhile, it reduced the levels of MDA, ET-1, and ROS in cells and increased the expression of eNOS.ConclusionTotal flavonoids fromAbelmoschusesculentusexert a protective effect against H2O2-induced oxidative stress injury in HUVECs, possibly by regulating oxidative stress factors (SOD, MDA, ET-1, and NO) and the expression of eNOS, the protein associated with endothelial cell function.

[Keywords]Abelmoschusesculentus; Total flavonoids; Oxidative stress injury; Human umbilical vein endothelial cell; endothelial nitric oxide synthase