远端上游元件结合蛋白1调节肝癌细胞中长链非编码RNA表达的实验研究

张波，李先鹏，许丰，姜玉华，吴益峰，陈颖

远端上游元件结合蛋白1（FUBP1）是近期发现的一种DNA结合蛋白，通过与远端上游元件FUSE结合调控c-myc基因转录表达，影响其介导的细胞生长、增殖、分化及凋亡，进而导致多种癌症的发生、发展[1-2]。研究发现FUBP1在70%的肝癌患者中高表达，与存活率呈显著负相关。体外研究确认FUBP1能诱导肝癌细胞增殖，可作为肝癌治疗的潜在靶点[3-4]。长链非编码RNA（lncRNAs）是近年来生命科学研究领域中最重要的调控因子之一，在机体发育和疾病发生发展过程中发挥着复杂而精确的调控功能[5-6]，但其具体机制尚未阐明。本研究通过lncRNA芯片技术，检测了三种不同的肝癌细胞系中过表达FUBP1后差异表达的lncRNAs，并利用生物信息学的方法对这些lncRNA进行了功能分析。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 肝癌细胞系（MHCC97H、MHCC97L和Huh7）为宁波市鄞州人民医院实验室冻存株。胎牛血清、细胞培养液、胰酶和抗生素为美国Gibco公司产品。RNA提取试剂为美国Thermo Fisher Scientific公司产品。lncRNAs芯片为Affymetrix公司产品。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和定量PCR试剂均为日本Takara公司产品。

1.2 慢病毒感染细胞 FUBP1过表达慢病毒的构建、包装、滴度测定由上海吉凯生物技术公司负责完成。将细胞接种于12孔细胞培养板，根据滴度将慢病毒适当稀释后感染细胞，12 h后更换为无病毒培养液，继续培养48 h。显微镜下观察细胞生长状态，经含puromycin抗生素的培养液筛选培养1周，并用于下一步实验。对照组为不含FUBP1的慢病毒。

1.3 lncRNAs芯片分析 各组细胞总RNA经质检合格后，反转录成双链cDNA，再进一步合成cRNA，接着对cRNA进行第二轮反转录合成cDNA，片段化并与生物素标记后与芯片杂交，洗脱和染色后利用Affymetrix Scanner 3000扫描得到原始图像。再经Affymetrix GeneChip Command Console软件处理提取原始数据，利用Expression Console软件进行genelevel和exonlevel的标准化处理。后续进行基因表达分析和共表达网络分析。

1.4 定量PCR 以提取总RNA为模板，利用逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，合成cDNA。反应程序为37℃，15min；85℃，5s。将适当稀释后的cDNA作为模板，进行SYBR Green法定量PCR反应。反应程序为95℃，5 s；60℃，30 s。共40个循环。通过公式2-△△Ct分析相对表达水平。以GAPDH基因作为内参基因。

1.5 统计方法 采用SPSS23.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，采用 检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒感染效率的鉴定 PCR结果显示，以对照组中 FUBP1的表达量为 1，慢病毒感染的MHCC97H、MHCC97L和 Huh7肝癌细胞株中FUBP1的mRNA水平分别为3.28±0.15、2.75±0.26和4.25±0.35，明显高于对照组（=22.129、10.934、14.954，均＜0.01）。封三彩图1。

2.2 过表达FUBP1后lncRNAs的表达变化 芯片结果显示，过表达FUBP1的MHCC97H、MHCC97L和Huh7肝癌细胞株中分别有565个、1143个和755个 lncRNAs出现明显的表达变化。合并分析显示12个 lncRNA在3种细胞株中具有一致的表达变化，包括3个上调和9个下调，见表1。

2.3 差异表达 lncRNAs结果的验证 随机选择6个一致表达变化的lncRNAs进行定量PCR验证。结果显示，lnc-KIAA1614-3、lnc-POU4F3-4和lnc-ARF6-3在3种细胞株均表达下调，lnc-ARF6-3的表达变化最明显，为对照组的（26.8±5.0）%。lnc-BCAS2-1、lnc-LYZ-2和lnc-EIF2AK4-7在3种细胞株均表达上调，lnc-BCAS2-1的表达变化最明显，为对照组的2.85±0.23倍（封三彩图2）。

2.4 差异表达lncRNAs与mRNAs的共表达分析将差异表达的lncRNAs与mRNAs进行共表达分析，共有19个mRNAs在3种细胞株种具有一致的表达变化。结果显示lnc-BCAS2-1、lnc-USP9X-3、lnc-LYZ-2和lnc-C14orf135-3与FUBP1具有共表达网络（封三彩图3）。

表1 FUBP1诱导的lncRNAs差异表达 个

3 讨论

原发性肝癌是全球常见的恶性肿瘤，其中肝细胞癌是肝癌最常见的病理组织学类型，约占肝癌的90%以上[7]。目前的研究表明，肝癌的发生是个多因素多步骤的长期而复杂的过程，致癌因素和肝脏各机制之间相互作用最终导致肝癌发生，但其具体调控机制目前尚无完全阐明[8-9]。本研究以目前研究热点之一—lncRNAs为目标，通过芯片的方法检测了受FUBP1诱导的lncRNAs，旨在为深入理解lncRNA在肝癌发生发展中的作用及调控机制，为肝癌的诊断治疗及预后提供新的方法和研究方向。

FUBP1是近期发现的一种DNA结合蛋白，通过与远端上游元件FUSE结合调控c-myc基因转录表达，影响其介导的细胞生长、增殖、分化及凋亡，进而导致多种癌症的发生、发展。从分子结构分析，FUBP1是由氨基酸末端结构域、含有4个KH基序的中央结构域及羧基末端结构域三部分构成，三个高度保守结构域是由可变的连接区域连接。其中通过KH结构域与配体位点的结合而起到对c-myc的调控作用[2,10]。肝癌细胞中过表达FUBP1引起差异表达的lncRNA可能也与c-myc的转录调控作用密切相关。

目前研究发现FUBP1在肝中分化及低分化细胞中均过表达，Western blot证实了肝癌组织中c-myc水平也同时升高，表明肝细胞癌形成过程中，FUBP1上调是引起c-myc表达增加的原因之一[11-12]。深入研究发现FUBP1主要诱导肿瘤细胞增殖，而FUBP2主要维持不同肝癌细胞系的扩散，且降低FUBP2水平会使FUBP1表达增加。同时肝癌组织中FUBP1的表达与stathmin的表达相关，FUBP1通过stathmin在肝细胞癌的发生、发展中发挥了一定的作用[3-4]。本研究的结果提示FUBP1对肝癌发生发展的作用也可能是由其诱导的lncRNA差异表达实现的。

IncRNAs与肝癌发生发展的研究是肝癌发病机制研究的当前热点之一[13]。在肝癌的发生发展过程中，肝癌细胞中非编码RNA的表达出现异常，并与癌细胞自噬密切相关[14-15]。多项研究结果说明lncRNA在肝癌的发生发展中具有重要作用[16-18]。本研究以受FUBP1诱导表达的lncRNA为方向，发现了12个在不同肝癌细胞株中具有一致表达变化的12个 lncRNAs，深入研究这些 FUBP1及这些lncRNAs对肝癌发生发展的调控作用和分子机制对肝癌的诊断和防治都具有重要的意义。

lncRNA在肝癌的发生发展中具有重要作用，但其对病理过程的调控机制目前尚未阐明。Wang等[19]发现lincGET与FUBP1形成RNA-蛋白复合物，促进长末端重复序列的顺式调节活性，并通过下调FUBP1蛋白水平，抑制RNA的可变剪切。Guo等[20]研究发现lncRNA PVT1的表达水平与FUBP1、cmyc的水平明显相关，提示其可能受到 FUBP1/cmyc的转录调控。Lnc-BCAS2-1基因坐落于人的1号染色体上，全长206 bp，但其作用和分子机制都尚未报道。笔者研究发现 FUBP1过表达后 lnc-BCAS2-1的表达变化最明显，并与其有共表达网络，提示其可能参与FUBP1调控肝癌发生的作用网络。

综上所述，本研究发现了不同类型的肝癌细胞株中过表达的FUBP1，利用芯片技术检测了差异表达的 lncRNAs，筛选了可能受 FUBP1调控的lncRNAs，并分析了lncRNAs与mRNA的共表达网络。研究结果提示FUBP1-lncRNAs的表达网络可能与肝癌的发生、发展和转移密切相关，深入探索其调控机制将为肝癌靶向治疗研究提供新的方向。

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