几株芽孢杆菌的生理生化、生长和产酶特性研究

梁晶晶 ，郑卫卫 ，赵 硕 ，张大伟 ，2*

（1.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛 266111；2.齐鲁工业大学，山东济南 250353）

芽孢杆菌在动物上应用主要依赖其在肠道或环境中繁殖分泌消化酶、维生素或抗菌物质而达到益生的功能。同一菌株在不同生长环境中繁殖和分泌产物能力有很大差异，不同菌株之间的生长潜力和分泌产物类别同样有较大差异。本文主要探究枯草与解淀粉芽孢杆菌的生理生化指标差异，及枯草、地衣与解淀粉芽孢杆菌低温生长和平板上的产酶比较，以期探寻三类芽孢之间性能差异的规律，为其在动物养殖中的应用方案提供菌株性能基础数据指导。

1 材料与方法

1.1 菌种 芽孢杆菌菌种来源见表1。

1.2 培养基 营养琼脂培养基：取33 g营养琼脂粉(北京陆桥)溶于1 L蒸馏水中，121℃灭菌30 min。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用1 mol/L NaOH溶液调节 pH为7.0，用蒸馏水定容至1 L，121℃灭菌30 min。

表1 评估的芽孢杆菌菌种来源

酪素培养基：干酪素10 g，酵母膏1 g，琼脂20 g，用1 mol/L NaOH溶液调节 pH为7.0，用蒸馏水定容至1 L，121℃灭菌30 min。

淀粉培养基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，用1 mol/L NaOH溶液调节 pH为7.2，用蒸馏水定容至1 L，121℃灭菌30 min。

1.3 染色液 酸性汞试剂：HgCl215 g，浓HCl 20 mL，加蒸馏水至100 mL。

卢哥氏碘液：碘片1 g，碘化钾2 g。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾中，待碘全溶后，加蒸馏水至300 mL。

1.4 试验方法

1.4.1 生理生化指标测定 将枯草芽孢杆菌1号和3号、解淀粉芽孢杆菌1号进行7%氯化钠生长、V-P测定、硝酸盐还原、D-甘露醇发酵、丙酸盐利用试验，方法参考《GB/T 26428-2010饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》。

1.4.2 生长曲线制作 从-80℃冰箱取出保种甘油管，用接种环挑取一环菌液，采用划线法接种到营养琼脂平板上，37℃培养至出现单菌落。从平板上挑取一环菌苔，接种到盛有100 mL LB液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养12 h，作为种子。

将种子液按3%接种量接种到盛有100 mL LB液体培养基中，15℃或28℃、200 r/min连续培养24～80 h，每隔4～8 h在超净工作台进行取样，采用分光光度计测定600 nm处吸光值，如菌液过浓，用纯净水进行适当稀释，吸光值控制在0.3～0.6，用相应稀释倍数的LB培养基作为对照。以培养时间t为横坐标，吸光值OD600为纵坐标，制作生长曲线图。

1.4.3 产酶性能测定 使用灭菌牙签挑取平板上的单菌落，分别点种在酪素培养基和淀粉培养基上，37℃培养箱中培养24 h。

通过酪素培养基观察产蛋白酶的能力，该培养基一般呈乳白色，菌株生长中产蛋白酶后菌落周围因蛋白被分解，乳白色褪掉而呈现透明，肉眼初步观察可见隐约的透明圈，在菌落周围滴加适量酸性汞试剂后，未被降解的蛋白遇酸性汞试剂变性，培养基底色白色加重，透明圈会更加明显，采用游标卡尺测量菌落及透明圈直径的大小。

通过淀粉培养基观察产淀粉酶的能力，该培养基一般无色透明，滴加卢哥氏碘液，轻摇平皿，使碘液铺满培养基表面，等待片刻，培养基中未被降解的淀粉遇碘变蓝，菌落周围淀粉被降解的的地方出现透明圈，同样采用游标卡尺测量菌落及透明圈直径的大小。

酶活力大小采用透明圈与菌落直径的比值表示，比值越大，表示该芽孢杆菌产酶的活力越大。

2 结果与分析

2.1 生理生化指标测定结果 试验结果表明，枯草1号、枯草3号和解淀粉1号三株菌都可在7%氯化钠培养基中生长。V-P测定三株芽孢杆菌都为阳性，枯草3颜色最深。硝酸盐还原测定中三株菌菌液浓度都较浓，红色不易观察，将发酵液稀释十倍后红色更明显，观察更方便，结果显示三株菌均为硝酸盐还原阳性。发酵D-甘露醇产酸验证试验表明，三株菌都可发酵D-甘露醇产酸使培养基变黄。试验中将三株芽孢杆菌接种在丙酸盐培养基上，经培养后其颜色均为深绿色，与对照组无显著差异，说明三株菌都不能利用丙酸盐。

2.2 生长曲线

2.2.1 15℃生长曲线 试验测定了芽孢杆菌在低温（15℃）下生长情况，每隔8 h取样测定吸光值，共培养80 h。试验表明，两株解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌1号在低温条件下生长好于其余两株枯草和地衣芽孢杆菌。随着时间延长，枯草芽孢杆菌1号的生物量最大，在72 h OD600达到8.0，两株解淀粉芽孢杆菌最高OD600也出现在48 h以后，最高值为3.8～4.4。枯草芽孢杆菌2号和3号在15℃下生长情况较差，48 h后才进入对数生长期，而两株地衣芽孢杆菌生物量80 h内一直低于1.0。综上，试验中两株解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌1号相较于其他四株芽孢杆菌更能耐受低温，较适宜在低温水产养殖水体应用（图1和图2）。

图1 枯草芽孢杆菌15℃生长曲线

图2 地衣和解淀粉芽孢杆菌15℃生长曲线

2.2.2 28℃生长曲线 芽孢杆菌在28℃下生长较为迅速，所评估的7株芽孢杆菌都在4 h内进入对数生长期，24 h即可到达稳定期，生长明显快于低温下。但研究表明，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌28℃下最高OD600值均低于15℃，因此，同一株菌28℃时最高生物量不一定高于15℃。地衣芽孢杆菌在低温下生长最差的状态，在28℃下长势甚至好于解淀粉芽孢杆菌和部分枯草芽孢杆菌（图3和图4）。

图3 枯草芽孢杆菌28℃生长曲线

图4 地衣和解淀粉芽孢杆菌28℃生长曲线

2.3 产酶性能测定结果 试验表明，这7株芽孢杆菌都能在酪素培养基以及淀粉培养基上生长并分解蛋白或淀粉，加入相应指示剂后出现透明圈。通过透明圈与菌落直径比值可知，这7株芽孢杆菌产蛋白酶能力由大到小排序为：解淀粉2＞解淀粉1＞枯草2＞枯草3＞地衣1＞地衣 2＞枯草1；产淀粉酶能力大小排序为：解淀粉2＞枯草3＞解淀粉1＞枯草1＞枯草2＞地衣2＞地衣1。可以发现解淀粉芽孢杆菌2号产两种胞外酶能力最强，两株地衣芽孢杆菌产酶能力不占优势（表2）。

表2 芽孢杆菌产酶能力测定结果

3 讨论

研究表明，枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌16S rDNA同源性较高，通过简单的测序鉴定也无法准确确定种属，需通过特性基因进行分析确定。卢娟等（2013）利用基因yyaR、tetB在解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中排列顺序的差异，利用引物yyaR-F/tetB-R对疑似解淀粉芽孢杆菌菌株进行了分类鉴定。汤际亮等（2013）根据生理、生化反应和菌株gyrB基因序列鉴定了枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，表明试验獭兔个体盲肠中解淀粉芽孢杆菌的数量多于枯草芽孢杆菌。刘勇等（2010）根据枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌基因组中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列，设计了特异引物，通过特异PCR方法对33株枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌进行有效的鉴定区分。本研究结果显示，通过简单生理生化指标无法区分枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，与董靖等（2016）的结论一致，表明在解淀粉芽孢杆菌的工业化生产中需结合特性基因进行亚种鉴定。

生长曲线是描述生物生长繁殖变化的曲线（王宏伟，1994），其可反映细菌在不同的培养条件下所表现出的生长规律和繁殖特点，细菌生长曲线的绘制方法有很多，有血细胞计数法、活菌计数法、称重法、分光光度法等。在严格控制培养条件的前提下，可通过测定培养液的OD值判断细菌是否进入对数生长期及细菌生物量变化（何岚等，2017）。本研究结果显示，温度对芽孢杆菌的繁殖影响很大，28℃时4 h内即进入对数生长期，15℃时24 h后才进入对数生长期；同一温度下三种菌之间及不同亚株之间生长情况差异显著 （P≤0.05）；研究发现15℃生长不好的地衣芽孢杆菌在28℃下却生长较好，所评估的所有枯草和解淀粉芽孢杆菌28℃时最高生物量均低于15℃。综上说明，要在某一特定动物或环境饲喂或使用芽孢杆菌制剂，需提前对其生长繁殖规律进行探究，以免因环境不适宜造成繁殖较差而起不到效果。此外，在15℃下应用芽孢杆菌可加大使用量，缩短其进入对数生长期的时间，但一旦繁殖起来，投加频率却不一定比温度高时频繁。

产生多种酶、促进动物对饲料营养的消化吸收是益生芽孢杆菌发挥益生作用的机制之一，有研究表明，枯草芽孢杆菌对动物日粮的消化效果明显优于地衣芽孢杆菌（陶荣霞，2012）。对芽孢杆菌产酶特性的研究可采用模拟消化法（刘秀侠等，2017；程德勇等，2014）和平板透明圈法（程德勇等，2014；徐良玉，2003）。本文采用平板透明圈法比较了待测芽孢杆菌的产蛋白酶和淀粉酶能力，结果显示在产酶方面除枯草3号的产淀粉酶能力较突出外，参与测试的其他枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产两种酶能力相近，均不及解淀粉芽孢杆菌。本研究以酪素作为蛋白、以可溶性淀粉（α-淀粉）作为淀粉进行分解蛋白和淀粉性能评估，结果表明解淀粉芽孢杆菌性能最优，但因不同饲料原料所含蛋白、淀粉的种类不同，对具体原料的分解效果需进一步进行评估。

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