一株枯草芽孢杆菌的鉴定及胞外多糖活性研究

张玲秀，白建华，郝瑞林，董社琴

（忻州师范学院生物系，山西忻州 034000）

多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，广泛存在于植物、真菌、藻类和细菌中。细菌胞外多糖是细菌产生的一类重要的生物大分子（赵霞等，2016），由于其具有抗菌、抗氧化性、免疫调节和抗癌等功能而备受关注（Zhang等，2016）。研究表明，从家蝇体内筛选出的枯草芽孢杆菌，其所产胞外多糖具有很强的清除氧自由基能力和抑真菌能力（张玲秀等，2013），因而本研究进一步对其所产胞外多糖进行多项活性检测，以期在食品、药物等方面提供可用活性物质，从而对枯草芽孢杆菌多糖的开发奠定理论基础，也为有益微生物的资源进一步开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源 前期家蝇体内筛选所得，低温保存。

1.1.2 培养基 LB固体和液体培养基 （周德庆，2006）。

1.1.3 试剂及仪器 LB固体和液体培养基购于北京奥博；引物1492r及27f和葡聚糖G-75购于Solarbio；小鼠白细胞介素-2（IL-2）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒 购于Biovision，其余均为国产分析纯。752N紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；PCR仪（杭州博日）；高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，HC-2062）。

1.1.4 试验动物及饲养条件 昆明种小白鼠，6周龄，体重约23 g，雄性，购于山西医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（晋）2009-001。饲养环境温度为18～29℃，相对湿度为40%～70%，自然通风，每天更换饮食和垫料。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种鉴定 从菌落形态和菌体显微形态结构观察和16S rDNA的序列同源性比进行鉴定（Houda 等，2017）。

1.2.2 细菌胞外多糖提取及纯化 采用Sevag法除蛋白，乙醇沉淀胞外多糖，然后用丙酮洗涤脱水，冷冻干燥后得深棕色粉末状固体，再经SephadexG-75凝胶柱层析纯化，苯酚硫酸法和核酸蛋白仪跟踪检测获得组分，冷冻干燥备用（伍渡清等，2013）。

1.2.3 胞外多糖对小鼠抗疲劳能力试验 将试验小鼠分为对照与给药（多糖）两组，每组10只，随机分组。每日灌胃给药量为50 mg/kg，对照组给等体积的无菌水，其他饲养条件相同，共饲养5 d。在第1天开始每天游泳训练10 min（在水温15～20℃、水深30 cm的红色桶内），第5天给药l h后，将小鼠进行负重耗竭游泳，记录从游泳开始到小鼠不能上浮（即死亡）的时间。

1.2.4 免疫器官指数的测定（Kwak等，2003） 分组同上，给药组每日灌胃多糖200 mg/kg，对照组采用同样方法灌胃相同体积无菌水。15 d后对所有小鼠称重。脱臼法处死小鼠，迅速的解剖小鼠并挑选出其胸腺和脾脏，用干净的滤纸吸去残留的血渍及其他杂质，并称量，按下列公式计算免疫器官指数：

1.2.5 小鼠体液免疫指标白介素-2测定 分组和给药方法同1.2.4所述，15 d后取试验小鼠的血液，离心法分离血清，按照小鼠白细胞介素-2（IL-2）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒说明书试验步骤，测定各组小鼠血清中白介素-2的含量。

1.2.6 小鼠巨噬细胞吞噬活性的测定 分组和给药方法同1.2.4所述，15 d后小鼠称重，每只小鼠尾静脉注射0.1 mL用生理盐水稀释3倍的墨汁，注入墨汁后2 min和10 min分别从尾尖取血20 μL，并立即加到 2 mL 0.1%（w/v）的 Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液为空白对照，波长675 nm处测定吸光值。最后脱臼法处死小鼠、解剖并挑选出肝脏，脾脏分别称重，按下列公式计算吞噬指数α。

式中：A1和A2分别为2 min和10 min尾尖取血测定的吸光值；t1为2 min，t2为10 min。

1.2.7 小鼠巨噬细胞溶菌酶活力的测定 小鼠颈椎脱臼处死后用生理盐水冲洗出腹腔巨噬细胞，取1 mL冲洗液置于25 mL比色管中，用硫酸铵溶液补足至10 mL，之后操作与标准曲线制作相同，在波长281 nm下测定吸光值，从溶菌酶标准曲线上确定此吸光度对应的溶菌酶含量。

1.2.8 MTT法检测Hela细胞生长抑制率（Kadowaki等，2013） 用提取纯化后的多糖，设置5个不同的多糖浓度梯度 （25、50、100、200、400 μg/mL），测定不同浓度多糖对Hela细胞生长的影响。细胞培养在37℃、5%CO2条件下进行。

生长抑制率（IR）/%=[1-试验组平均OD值/对照组平均OD值]×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料正态分布用表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分数表示，组间采用检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 16S rRNA的序列同源性比对结果及分析序列在NCBI上进行16S rDNA的序列同源性比对，采用phylogenetic Tree软件对菌株的测序结果进行遗传分析，分析结果见图1。供试菌株DQ与Bacillus subtilis的亲缘关系最近，同源性均达到99%。结合菌落形态及显微观察，鉴定为枯草芽孢杆菌（B.Subtilis DQ）。

图1 芽孢杆菌的16SrDNA系统发育树

2.2 胞外多糖对小鼠抗疲劳能力试验结果 在整个给药的过程中，试验组小白鼠并没有表现出身体的不良反应、各方面的反应迟钝、拒食等明显的中毒症状。然后在5 d后进行游泳抗疲劳试验，小鼠在桶里游泳前期非常的活跃，但到后期不能上浮为已死亡的小白鼠，分别记录每只小鼠死亡时间。由表1可知，给糖组小鼠游泳时间明显高于对照组。

表1 胞外多糖对小鼠抗疲劳能力的影响

2.3 胞外多糖对小鼠免疫器官指数的作用结果由表2、3可知，胞外多糖组免疫器官指数显著上升，表明枯草芽孢杆菌多糖可以显著提高免疫器官的功能。

表2 胞外多糖对小鼠脾脏指数的影响

表3 胞外多糖对小鼠胸腺指数的影响

2.4 胞外多糖对小鼠体液免疫指数的作用结果通过测定小鼠IL-2浓度变化以研究其对体液免疫功能的作用，通过绘制标准曲线（见图2）计算出样品浓度，试验结果见表4。

图2 小鼠IL-2不同浓度下的吸光值

表4 胞外多糖对小鼠IL-2浓度的影响

由表4可知，试验组与对照组相比，其IL-2指标的平均值显著上升，通过单因素方差分析可知，P=0.013<0.05，即具显著性，具有统计学意义。由此说明，枯草芽孢杆菌多糖对小鼠的体液免疫功能有一定的增强作用。

2.5 胞外多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的作用结果 小白鼠碳粒廓清试验可衡量机体免疫功能，所反映的是巨噬细胞的吞噬功能。从表5中可以看出给药组小鼠巨噬细胞吞噬活性显著高于对照组，表明芽孢杆菌多糖具有增强机体巨噬细胞吞噬活性的潜在功能。该菌多糖能增强生物体内的非特异性免疫功能，这对提高机体的整个免疫功能意义重大。

表5 胞外多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响

2.6 胞外多糖对小鼠腹腔巨噬细胞溶菌酶活力的作用结果 溶菌酶广泛存在于多种细胞内，通过水解致病菌中黏多糖而在免疫第二道防线中发挥重要作用，主要用于免疫和防御。因此溶菌酶活力的测定能很好地反映机体的免疫功能。从表6中可以看出给药组显著高于对照组，表明该多糖能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的溶菌酶活力，提高非特异性免疫功能。

表6 胞外多糖对小鼠巨噬细胞溶菌酶活力的影响

2.7 胞外多糖对肿瘤细胞生长的抑制作用 采用MTT法检测多糖对Hela细胞生长代谢活力的影响，结果见图3。多糖对Hela细胞的抑制具有时间和剂量效应，随多糖浓度的升高和时间延长抑制率升高。 400 μg/mL多糖处理48 h后细胞生长抑制率最高可达到50.77%。可见此多糖具有体外抑制癌细胞生长与增殖的毒性，因此有望开发成一种新的抗肿瘤药物。

图3 多糖对Hela细胞生长抑制率柱形图（24 h、48 h）

3 讨论

大多细菌多糖是高复杂、多样的结构，具有很多功能特性，许多微生物产生的胞外多糖吸附于微生物细胞表面或悬浮于培养液中，已被证实胞外多糖具有防御致病菌的作用，现在对抗癌、免疫活性以及在骨骼和组织再生方面的作用越来越受关注。

细菌胞外多糖作为天然产物，可大量发酵提取，且可降低成本，在国内外，不断对植物、微生物等方面来源的多糖类物质进行开发和利用，但是对其分子机制还不很明确，有待进一步研究，多糖结构和活性之间的关系还有待进一步发掘（Jung 等，2015）。

枯草芽孢杆菌是一类非致病性革兰氏杆菌，可在胞外形成荚膜，使其对外界不良环境具有抗性，主要由胞外多糖组成，细菌将其分泌至胞外，与环境营养因子有关（Stanislava等，2016）。 益生菌（如芽孢杆菌）在黏膜和系统水平可调节免疫应答，细菌胞外多糖是充当益生菌和宿主间免疫应答相互作用的媒介，此外，胞外多糖对可诱导巨噬细胞和淋巴细胞的免疫应答，巨噬细胞被认为可通过活化巨噬细胞扮演宿主防御和免疫调节活化免疫应答。他们是可以攻击、破坏和摄入癌细胞、外源物质和传染性细菌的一类特化巨噬细胞，胞外多糖对免疫细胞具有强有力的免疫激活作用归因于其可增强一氧化氮和细胞因子的含量。然而，细菌胞外多糖有益的生物活性研究未受到充分重视，依然存在一些缺点，如研究和应用的速度较慢，没有充分考虑各种类型胞外多糖具有的独特生物活性等。目前，关于细菌胞外多糖的医学生物活性研究，大多数都还处于体外试验阶段（Wang等，2015）。

本研究从家蝇体内筛选出一株枯草芽孢杆菌，发现其不仅具有很好的抗氧化作用，而且可以显著提高小鼠免疫力和体外抗肿瘤细胞作用。家蝇具有较强的抗病能力可能与其共生益生菌有关，因而对此多糖的结构及免疫机理仍需进一步研究。

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