黄芪不同溶剂提取物抑制前列腺增生的研究

罗孟雄，林桂涛

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250014)

黄芪(Astragali Radix)为豆科植物蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根,具有补气固表、利水消肿等功能。前列腺增生症(BPH)是老年男子常见疾病之一，而且随着我国人口老龄化的加剧，前列腺增生症发病率越来越高。黄芪因具有补气、利水的功能，在中医治疗前列腺增生症的临床中常被应用[1]。目前，已有文献报道黄芪对前列腺增生症具有缓解作用[2-4]，但对黄芪治疗前列腺增生的成分及机理研究的较少。本研究通过比较黄芪不同溶剂提取物对前列腺增生模型大鼠前列腺增生的作用，为推测黄芪抑制前列腺增生活性成分提供依据，为制定黄芪用于治疗前列腺增生症的提取工艺奠定基础。

1 仪器与材料

万分之一电子分析天平(上海精科天美科学仪器有限责任公司)；十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；TU-1901型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)；ZW-SX型数显恒温平滑肌槽(淮北正华生物仪器有限责任公司)；RM6240B型多道生理信号采集处理软件系统(成都仪器厂); 680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

SD大鼠雄性，4周龄，由山东鲁抗有限责任公司所培育提供，许可证号为SCXK(鲁)20140003。

黄芪购自济南市建联中药有限公司，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge．var．mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根，经检测符合《中国药典》2015年版的要求[5]；丙酸睾酮注射液(规格：25 mg/mL，宁波第二激素生产厂，批号为150108)；NaCl(天津市巴斯夫化工有限公司)；KCl(天津市化学试剂一厂)；NaHCO3(天津市巴斯夫化工有限公司)；KH2PO4(天津市巴斯夫化工有限公司)；MgSO4(天津市化学试剂六厂)；葡萄糖(天津博迪化工生产提供)；无水CaCl2(天津市化学试剂一厂)。睾酮酶联免疫分析试剂盒、二氢睾酮酶联免疫分析试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2 实验方法与结果

2.1 黄芪不同溶剂提取物的制备

称取黄芪粗粉(过3号筛)100 g共4份，分别加入水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇(均为体积分数)加热回流提取2次，每次加溶剂1 000 mL，每次2 h，滤过，合并提取液，浓缩至无醇味，加水定容至100 mL摇匀，即得4种黄芪不同溶剂的提取液[6-8]。

2.2 黄芪不同溶剂提取物对前列腺增生抑制作用的测定

2.2.1 灌胃液的制备

量取黄芪提取液85 mL，浓缩至50 mL作为灌胃药液备用。

2.2.2 分组及给药

取SD雄性大鼠60只，随机分为6组(正常对照组、模型组，水提取物组，50%乙醇提取物组，75%乙醇提取物组，95%乙醇提取物组)，每组10只。适应性喂养7 d后，采用7%水合氯醛溶液(每100 g溶液含氯醛0.5 mL)腹腔注射，麻醉大鼠，进行两侧睾丸无菌切除，切除手术结束后自然恢复1周后，除正常对照组外，其他各组大鼠皮下注射丙酸睾酮5 mg/(kg·d)[9-10]，同时灌胃给药不同溶剂黄芪提取物10 g/(kg·d)灌胃液，正常对照组灌胃给予等体积水，连续给药28 d,并定时称量各组的大鼠的体重。

2.2.3 大鼠血清睾酮和二氢睾酮浓度的测定

大鼠于最后1次给药后禁食 12 h。 每组大鼠分别称其体重后，眼静脉丛取血，分离血清，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)进行睾酮(testosterone，T)和二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)的测定[11-12]。结果见表1。

表1 各组大鼠(每组10只)血清睾酮和二氢睾酮指标比较Table 1 Comparison of testosterone and dihydrotestosterone indexes in the serum of each group (10 mice each)

注：与模型组相比，*P<0.05或**P<0.01；95%乙醇提取物组与其他提取物组比较▲▲P<0.01。

由表1可知，模型组血清睾酮和二氢睾酮的浓度均比正常对照组显著高(P<0.01)，说明注射丙酸睾丸酮能够升高血清睾酮与二氢睾酮的水平。用药组血清睾酮水平显著比模型组低(P<0.05)；除了水提取物组外，其他用药组二氢睾酮水平比模型组显著低(P<0.05)，其中95%乙醇提取物组与模型组比较有极显著的差异(P<0.01)。综合两种参数水平，95%乙醇提取物具有更好的降低血清睾酮和二氢睾酮水平的作用。

2.2.4 前列腺系数的测定

大鼠脱颈处死，迅速解剖，取出前列腺称重，计算前列腺系数[13]。结果见表2。

2.2.5 大鼠离体膀胱逼尿肌条收缩强度信号测定

表2 各组大鼠前列腺系数和大鼠离体膀胱逼尿肌条收缩强度的比较

注：与模型组比较，**表示P<0.01；95%乙醇组与其他提取物组比较▲表示P<0.05，▲▲表示P<0.01。

由表2可知，模型组与正常对照组比较，前列腺系数显著增加(P<0.01)，说明造模成功。各给药组与模型组比较，前列腺系数显著减小(P<0.01),说明各溶剂提取物均具有抑制前列腺增生的作用；另外，95%乙醇提取物组前列腺系数与其他提取物组比较有显著的差异(P<0.05)。

大鼠注射丙酸睾酮后能显著减小膀胱逼尿肌的收缩强度(P<0.01)，各给药组与模型组比较，逼尿肌收缩强度显著增加(P<0.01)，说明黄芪提取物具有增加前列腺增生模型大鼠的排尿力度；各给药组比较，95%乙醇提取物组膀胱逼尿肌收缩强度与其他提取物组比较有极显著的差异(P<0.01)。

另外，在比较了黄芪不同溶剂提取物抑制前列腺增生作用的基础上，又测定了各提取液中相关成分的含量，结果见表3。

表3 黄芪不同溶剂提取物中相关成分含量(mg/g)Table 3 Content of correlative component in different solvent extracts from Astragali Radix (converting into the content of raw pieces)(mg/g)

由表3可以看出，黄芪不同溶剂提取物抑制前列腺增生的效果与提取物中的黄芪甲苷、总皂苷、毛蕊异黄酮苷、总黄酮的含量不呈相关性，而与毛蕊异黄酮有较好的的相关性。

3 结论与讨论

(1)治疗前列腺增生药物的药效学研究的动物模型通常有猩猩或猴BPH模型、尿生殖窦植入法小鼠或大鼠模型、老龄犬自发性BPH模型和雄激素诱导大鼠或小鼠BPH模型。相对于其他模型，雄性激素诱导大鼠或小鼠BPH模型具有方法简便、可靠、周期短、重现性好的特点，特别适用于作为中药筛选、制备工艺筛选的生物考察方法。

(2)黄芪已证明具有较好的利尿作用，已经证明的机制为竞争性抑制Na+-K+-ATP酶活力有关，可以缓解前列腺增生患者尿道梗阻的症状，但其对膀胱逼尿肌条收缩强度是否有影响未见报道，如果证明其能增加膀胱逼尿肌收缩的收缩强度，则对前列腺增生症造成的排尿困难症状更有说服力。

(3)目前治疗前列腺增生症的主要化学药物为5ɑ-还原酶抑制剂，其能够抑制睾酮向雄性激素作用更强的二氢睾酮转化，减小血清中二氢睾酮的浓度，减轻增生前列腺的体积。

(4)黄芪4种不同溶剂提取物均具有较好的抑制前列腺增生的作用，均能够抑制前列腺的增生，其中95%乙醇提取物作用更加明显，前列腺系数更小，与其他提取物组比较有显著差异；黄芪提取物还能增加前列腺增生模型大鼠膀胱逼尿肌收缩的收缩强度，所以能够减轻前列腺增生症排尿无力、排尿困难的症状，其中仍然以95%乙醇提取物效果更好，与其他提取物组有显著的差异。

(5)黄芪4种提取物均能降低前列腺增生模型大鼠血清中的睾酮和二氢睾酮浓度，这可能是其抑制前列腺增生的机理，其中仍然以95%乙醇提取物作用更加明显。

(6)黄芪4种提取物的作用效果与提取物中总皂苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷的含量无相关性，而与毛蕊异黄酮的含量呈较好的相关性，这可能是苷元能够被吸收，而相应的苷不能被吸收造成的。

参考文献：

[1]张蔷.黄芪对间歇低氧大鼠海马及胰腺损伤的作用及其机制研究[D].天津：天津大学,2013.

[2]徐薇,庄田畋.黄芪及其复方在良性前列腺增生症中的研究进展[J].贵阳中医学院学报，2017，39(2)：93-97.

[3]程林凤.去势与非去势对睾酮诱导的大鼠前列腺增生的影响[D].沈阳：中国医科大学,2009.

[4]楚元奎,杨文,冉林武,等. 前列腺增生大鼠模型的建立[J]. 贵阳医学院学报,2014,39(5):657-659.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版.一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：302.

[6]崔雪莹,刘阿娜,陈迩东,等. HPLC-ELSD法测定黄芪中四种皂苷类成分的含量[J]. 山东中医杂志,2017,36(5):411-413.

[7]张萍. 甘肃黄芪和红芪中总皂苷含量测定对比研究[J]. 云南化工,2017,44(8):49-50.

[8]尹震,宋茜,赵楚文,等. 两种紫外-可见分光光度法测定黄芪中总皂苷含量的比较研究[J]. 海峡药学,2017,29(6):24-27.

[9]楚元奎,杨文,冉林武,等.前列腺增生大鼠模型的建立[J].贵阳医学院学报,2014,39(5):657-659.

[10]吕水林. 补肾活血通淋方对良性前列腺增生症大鼠模型Bcl-2、Bax影响的研究[D].郑州：河南中医学院,2012.

[11]陈江林,熊丽娇,江丽霞,等.葛根素对性激素及前列腺增生组织中雌激素受体表达的影响[J].时珍国医国药,2014,25(8):1820-1822.

[12]王毓平,李小林,刘永青,等.车前子提取物抑制大鼠前列腺增生及对5α-还原酶的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(15):3643-3646.

[13]刘向云,邱晓燕,吴建辉,等.雌/雄激素比例对去势大鼠前列腺体积及其脏器系数的影响[J].中国实验动物学报,2007，15(2):129-132.

[14]张春和. 前列冲剂治疗前列腺增生症膀胱逼尿肌收缩功能受损的临床研究[D].北京：北京中医药大学,2002.

[15]杨宇峰,刘荣福,陈斌,等.经尿道前列腺电切除术治疗前列腺增生合并膀胱逼尿肌无反射的临床疗效观察[J].中国内镜杂志,2014,20(2):180-182.

[16]张亚龙,高继学,张烨.良性前列腺增生症患者膀胱壁和逼尿肌厚度改变的相关研究进展[J].新医学,2017,48(10):688-691.