HPLC法测定丁白贴剂成分含量的研究

张慧，张丽美，刘善新，苏酩，李莹，赵立建

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

浆细胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis)又称为乳腺导管扩张症，是以乳腺导管阻塞导致扩张、浆细胞受到浸润为病变基础的慢性非细菌性乳腺炎症[1]。目前浆细胞性乳腺炎的治疗方法主要包括西医的手术切除法和中医疗法，中医疗法包括中药内治法和外治法两种，其中中药外治法由于直接作用于病灶，见效快，副作用小，能够彻底治愈等优点而具有明显优势。

丁白贴剂来源于临床经验总结方，具有温通化瘀的功效，用于初期及中期浆细胞性乳腺炎的治疗。贴剂由花椒(Zanthoxyli pericarpium)、丁香(Caryophylli flos)、赤芍(Paeoniae radix rubra)等中药组成，对处方中的药材经过提取纯化，再以热塑性压敏胶为基础胶黏剂，加入其他基质制成贴剂，使用方便，可随时贴敷和停用，无创伤性，可持续给药。丁香酚为丁香的主要成分，现代药理学实验表明，丁香酚具有消炎、镇痛、增强免疫、抗肿瘤、促进透皮吸收等作用[2-3]。赤芍主要含有芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等[4]。具有清热凉血，散瘀止痛的功效，现代临床研究表明芍药苷具有增强免疫功能、抗炎、镇痛等作用[5]。为制定该制剂的质量标准，参考有关文献[6-7]对其所含的丁香酚、芍药苷进行了含量测定研究，并进行了方法学考察。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪；Ultimate 3000紫外检测器，Chromeleon7工作站(美国Thermo公司)；色谱柱： Lichrospher C18柱(江苏汉邦科技有限公司)；HH-4数显电子恒温水浴锅(江苏金坛市晶玻厂)；Sartorius BP211D电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 试药

处方中赤芍等饮片购于山东百味堂中药饮片有限公司，均为2015年版《中国药典》一部[8]各药材项下收载的正品饮片；芍药苷对照品(批号110736-201438)、丁香酚对照品(110725-201615)均购自中国食品药品检定研究院；纯净水(杭州娃哈哈)；所用试剂甲醇、乙腈均为分析纯或色谱纯。

2 方法与结果

2.1 条件与制备

2.1.1 色谱条件

2.1.2 供试品溶液的制备

丁香酚：取本品膏体约2 g，剪碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声(频率40 kHz，功率300 W)30 min，放冷后称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，以0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅰ。

芍药苷：取本品膏体5 g，剪碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷称重，甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，水浴蒸干，残渣加水20 mL溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15 mL，水液用水饱和的正丁醇萃取4次，每次15 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度摇匀，以0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液Ⅱ。

2.1.3 对照品溶液的制备

丁香酚：精密称取丁香酚对照品，加甲醇配成浓度为47.2 μg·mL-1的溶液作为丁香酚对照品溶液。

芍药苷：精密称取芍药苷对照品，加甲醇分别配制成浓度为27.3 μg·mL-1、54.6 μg·mL-1溶液作为对照品溶液。

2.1.4 空白对照溶液的制备

按处方比例，分别称取除丁香、赤芍以外的其他药材，模拟本品的制备工艺和供试品的制备方法，分别制成缺丁香空白对照溶液、缺赤芍空白对照溶液。

2.2 测试结果

2.2.1 空白干扰实验

分别精密吸取丁香酚对照品溶液、供试品溶液Ⅰ、缺丁香空白对照溶液和浓度为27.3 μg·mL-1的芍药苷对照液、供试品溶液Ⅱ、缺赤芍空白对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.2.1色谱条件检测，结果表明丁香酚、芍药苷对照液和供试品溶液在相同的保留时间均呈现吸收峰，而缺丁香、缺赤芍空白液在与对照品相应的位置上未见色谱峰出现，见图1、图2，这表明本测定无干扰。

图1 丁香酚含量测定HPLC图Fig. 1 HPLC chromatogram for the determination of eugenol content

图2 芍药苷含量测定HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram for the determination of paeoniflorin content

2.2.2 线性关系考察

分别精密吸取丁香酚对照品溶液1、3、5、7、10 μL进样测定，浓度为54.6 μg·mL-1的芍药苷对照品溶液1、3、5、7、9 μL进样测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，结果丁香酚线性范围为0.0472～0.472 μg，回归方程为：Y=14.52X-0.044，相关系数R=1.000 0；芍药苷线性范围为0.054 6～0.491 4 μg，回归方程为Y=19.81X+0.079，相关系数R=0.999 9。

2.2.3 精密度

分别精密吸取丁香酚对照品溶液、芍药苷对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，连续测定5次，测得丁香酚的峰面积积分值相对标准偏差为0.119%，芍药苷的峰面积积分值相对标准偏差为0.448%。

2.2.4 稳定性

分别精密吸取丁香酚供试品溶液和芍药苷供试品溶液各10 μL，在0，3，6，9，12，24 h 各进样一次，共进样测定6次，测其峰面积积分值，丁香酚相对标准偏差为0.197%，芍药苷相对标准偏差为0.647%。

2.2.5 重复性考察

丁香酚：取同一批样品(批号：20170206)约2 g，共取6份，精密称定，按2.2.2项下供试品溶液Ⅰ方法制备供试液并测定丁香酚的含量，结果6次测定的丁香酚的平均含量为0.404 8 mg·g-1，其相对标准偏差为1.62%。

芍药苷：精密称取同一批(批号：20170206)样品膏体5 g，平行操作6份，按2.2.2项下供试品溶液Ⅱ方法制备供试液并测定芍药苷的含量，结果6次测定的芍药苷平均含量为0.02681 mg·g-1，相对标准偏差为1.35%。

2.2.6 回收率

丁香酚：采用加样回收法，精密称取已测知丁香酚含量的同一批样品(批号：20170206)约1 g，共6份，分别加入0.431 mg丁香酚混匀，制成供试品溶液，按2.2.1项下方法测定，结果丁香酚的平均回收率为97.18%，相对标准偏差为1.96%。

芍药苷：采用加样回收法，精密称取已测知芍药苷含量的同一批样品(批号：20170206)膏体2.5 g，分别加入芍药苷对照品0.068 mg，混匀，平行6份，制成供试品溶液测定，结果芍药苷平均回收率为98.56%，相对标准偏差为1.24%。

2.2.7 样品的测定

分别精密吸取丁香酚、芍药苷对照品溶液与3批供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，并计算各批样品中丁香酚、芍药苷的含量，结果见表1。

表1 3批样品含量测定结果(每贴含量)

3 讨论

本贴剂的膏体较粘稠，在芍药苷测定供试品溶液的制备中选用加热回流提取法，将制剂中的有效成分提取更完全。对提取液纯化时先用乙酸乙酯萃取除去脂溶性杂质，再以水饱和的正丁醇提取富集芍药苷，经处理后的供试品溶液适宜于高效液相进样分析。

本研究确定的丁白贴剂中丁香酚、芍药苷的含量测定方法可行性、重复性好，可作为本制剂的含量测定方法，为制定可行可控的质量标准奠定了实验基础，同时也可以为同类制剂的含量测定提供参考。

参考文献：

[1]唐润薇.浆细胞性乳腺炎急性期切开引流术疗效及术后切口愈合影响因素分析[J].河北医药,2016,38(23):3627-3629.

[2]彭宅彪，张琼光，代虹健，等.丁香酚的药理学研究进展[J].时珍国医国药,2006,17(10):2079-2081.

[3]王冬梅，李静，徐月红，等.宝泻灵提取物的体外透皮吸收研究[J].中草药,2007,38(10):1487-1490.

[4]吴修红，孙晓兰，胡妮娜，等.赤芍功效物质基础研究进展[J].中医药信息，2017,34(2):120-122.

[5]陆小华，马骁，王建，等.赤芍的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药,2015, 46(4):595-602.

[6]余小平.高效液相色谱法测定丁香中丁香酚的含量[J].药物分析杂志,2008,28(6):975-977.

[7]谢晓梅，余长柱，徐衡，等.赤芍饮片质量标准研究-芍药苷的含量测定[J].中国中药杂志,2004,29(8):759-762.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.