Th1/Th2趋化因子及其受体在大疱性类天疱疮皮损中的表达

王东霞，叶珊珊，李莹洁，王再兴

大疱性类天疱疮(bullous pemphegoid, BP)是好发于老年人的自身免疫性大疱性皮肤病，发病机制尚不完全明确。近年来，趋化因子及其受体在自身免疫性疾病发病中的作用是国内外学者研究的热点。研究[1-3]证实，趋化因子参与天疱疮、系统性硬化症和银屑病等自身免疫性疾病发病过程。该研究应用免疫组化方法观察BP患者皮损中Th1/Th2趋化因子及其受体的表达，探讨其与BP发病机制是否相关，以对BP的发病机制有更深入的了解。

1 材料与方法

1.1病例资料50 例BP患者来自2016年1月～2016年12月在安徽医科大学第一附属医院皮肤科门诊就诊和住院治疗患者,所有病例经临床表现、组织病理、免疫荧光等检查明确诊断为BP，其中女28例,男22例，年龄21～92(69.56±15.82)岁。30例对照组系我院皮肤科手术切除的健康人皮肤，女20例,男10例，年龄8～73(33.33±15.20)岁。

1.2方法

1.2.1主要试剂 兔抗人CXCL9多抗、兔抗人CXCL11多抗、兔抗人CCL17单克隆抗体、兔抗人CCL22多抗、小鼠抗人CXCR3单克隆抗体、兔抗人CCR4多抗，购自美国Abcam公司；二抗试剂盒(PV-6000)、DAB试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2实验方法 免疫组化SP法染色，按SP试剂盒说明操作。显微镜观察所有染色切片趋化因子及其受体的表达，以细胞和细胞间质呈现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片随机选取5个完整而不重复的显微镜下视野，应用JEOR801D 图像分析软件测定每个视野下4种趋化因子及受体表达的光密度(OD)值，最后取其平均值进行统计学分析。

2 结果

2.14种趋化因子及其受体的表达部位对照组中4种趋化因子及其受体只在表皮基底细胞层中少量表达，细胞膜和细胞间质可见棕黄色颗粒；BP患者皮损中4种趋化因子及其受体主要表达于表皮基底细胞层和中上部棘细胞层细胞质和细胞膜，尤其是淋巴细胞浸润部位，在乳头层血管内皮细胞、水疱的疱顶及水疱间质均有表达。见图1。

2.24种趋化因子及其受体在BP患者及健康对照皮肤中的表达数量BP皮损中4种趋化因子及其受体阳性表达的OD值均高于对照组。其中，BP皮损中Th1趋化因子CXCL9、CXCL11及其受体CXCR3表达的OD值分别为(0.55±0.09)、(0.38±0.06)和(0.37±0.04)，Th2趋化因子CCL17、CCL22及其受体CCR4表达的OD值分别为(0.42±0.10)、(0.35±0.04)和(0.42±0.05)。对照组中CXCL9、CXCL11及其受体CXCR3表达的OD值分别为(0.26±0.08)、(0.18±0.04)和(0.22±0.02)，CCL17、CCL22及其受体CCR4表达的OD值分别为(0.25±0.12)、(0.21±0.03)和(0.24±0.07)。4种趋化因子及其受体在BP皮损和对照组皮肤中的表达差异均有统计学意义(均P<0.01)，见表1。

3 讨论

CD4+T细胞在适应性免疫反应过程中起关键作用，这些细胞需精确和协调地迁移至炎症部位才能适当发挥效应功能。细胞归巢由细胞膜上趋化因子受体的动态表达来控制，不同CD4+T细胞子集根据其表达趋化因子受体不同，与特定趋化因子结合发生定向迁移[4]。Th1细胞表达的典型趋化因子受体是CXCR3，CXCR3轴是典型的炎症轴，CXCR3在原始T细胞上不存在，而配体仅在细胞暴露于炎性刺激时诱导产生。CXCL11是最有效的配体，其次是CXCL10和CXCL9[5]。 CXCR3对于Th1细胞的募集是至关重要的，在缺乏CXCR3的情况下，感染、自身免疫性疾病和许多癌症中的Th1细胞迁移受到抑制[6]。Th2细胞优势表达CCR4，特异性配体是CCL17和CCL22[7]。特应性皮炎模型中，CCR4缺陷的Th2细胞不能迁移至炎症部位，这对引发皮肤炎症是必不可少的[8]。

图1 BP患者皮损和对照组皮肤中4种趋化因子及其受体免疫组化结果 SP×200A：BP组；B：对照组；1：CXCL9；2：CXCL11；3：CCL17；4：CCL22；5：CXCR3；6：CCR4

表1 BP皮损和对照组皮肤中4种趋化因子及其受体的表达

BP180胞外跨膜结构域-非胶原16A结构域(NC16A)是自身抗体作用的主要靶点，BP180 NC16A特异性自身抗体主要是IgE和IgG，抗体血清水平与疾病活动性相关[9]。多数BP患者体内具有自身反应性T细胞，主要与细胞膜上BP180NC16A位点结合，这些T淋巴细胞属于CD4+T细胞，可以生成Th1/Th2混合细胞因子[10]。研究[11]认为，Th1和Th2细胞因子的血清水平升高与BP患者的疾病活动相关。Th1细胞因子(如IFN-γ)能够诱导IgG1和IgG2的分泌，而Th2细胞因子(如IL-4，IL-5和IL-13)可以调节IgG4和IgE的分泌，BP患者血清中同种型抗BP180和抗BP230抗体IgG1、IgG4和IgE的检测表明，自身反应性Th1和Th2细胞参与了对BP靶抗原反应的调节。

Kakinuma et al[12]通过检测20例BP患者血清和疱液中CCL17水平及4例BP患者皮肤组织中CCL17表达水平，发现BP患者血清、疱液和皮损中CCL17水平升高，且血清CCL17水平与嗜酸性粒细胞水平及疾病活动性呈正相关，治疗后水平下降。Echigo et al[13]通过检测27例BP患者血清中CXCL9和CCL17、CCL22的水平，发现它们的血清水平均升高，随着病情缓解其水平下降。国内耿士玲 等[14]应用免疫组化方法检测30例BP患者皮损中Th1 趋化因子 CXCL9、CXCL10、CXCL11和Th2型趋化因子CCL22及其受体CXCR3、CCR4的表达，结果显示BP皮损中4种趋化因子及其受体的表达均高于对照组皮肤。本研究使用免疫组化方法，并首次应用光密度(OD)技术检测50例BP患者和30例对照组Th1趋化因子CXCL9、CXCL11和Th2趋化因子CCL17、CCL22及受体CXCR3 、CCR4的表达情况。研究结果显示，BP患者和对照组中4种趋化因子及其受体仅表达于表皮层，细胞膜和细胞间质可见棕黄色颗粒；BP患者皮损中4种趋化因子及其受体主要表达于表皮基底细胞层和中上部棘细胞层，尤其是淋巴细胞浸润部位，在乳头层血管内皮细胞、水疱的疱顶及水疱间质均有表达。对照组皮肤中只在表皮基底细胞层表达。BP患者皮损中4种趋化因子及其受体阳性表达的OD值均高于对照组。证实BP患者皮损中Th1和Th2趋化因子表达水平均升高，提示其在BP患者体内Th1和Th2细胞募集过程中起重要作用，从而参与BP发病过程。

本研究结果表明趋化因子可能参与了BP发病过程，其与细胞因子及炎症细胞相关作用机制还需进一步探索。

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